莫平莉王洛臨?盧 泳陳雪婷馮健英徐文杰李智勇

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院／廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510095）

黃芪配方顆粒的提取采用2 次煎煮方法，目前相關(guān)工藝的制定是通過(guò)間斷取樣及HPLC 法、紫外-可見(jiàn)分光光度法等來(lái)反映提取液中指標(biāo)成分含有量，并優(yōu)化提取方案［1-3］，但這些方法會(huì)使提取信號(hào)滯后，導(dǎo)致無(wú)法及時(shí)調(diào)整提取方案，并且存在樣品處理復(fù)雜、步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)儀器設(shè)備要求高等缺點(diǎn)［4-5］。因此，需尋找 1種精準(zhǔn)簡(jiǎn)便的方法來(lái)對(duì)黃芪配方顆粒的提取過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，以便及時(shí)優(yōu)化提取方案，確定提取終點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)利用黃芪提取液顯示電信號(hào)的表征，通過(guò)關(guān)聯(lián)其電導(dǎo)率與指標(biāo)成分（黃芪甲苷、黃芪多糖、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷）含有量之間的關(guān)系，對(duì)提取過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，為研究該制劑提取過(guò)程中的傳質(zhì)規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 e2695 型 HPLC 色譜儀，配置 2424 型ELS 檢測(cè)器、2998 型 PDA 檢測(cè)器（美國(guó) Waters 公司）；DDS-307A 型電導(dǎo)率儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；LXJ-ⅡB 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；JJ500 型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠(chǎng)）；TLE204 型分析天平（瑞士 Mettler-Toledo 公司）；HH 系列數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）。

1.2 試藥 黃芪甲苷（CAS 號(hào)84687-43-4，含有量＞98%）對(duì)照品購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào) 11920-201203，含有量 97.3%）、D-無(wú)水葡萄糖（批號(hào)110833-201506，含有量 99.9%）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。黃芪（批號(hào)160301）購(gòu)自廣州市金芝中藥飲片公司，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院王洛臨主任中藥師鑒定為正品，符合2015年版 《中國(guó)藥典》 一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。D-101型大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)自天津浩聚樹(shù)脂科技有限公司。乙腈為色譜純；甲醇、苯酚等均為分析純；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷含有量測(cè)定

2.1.1 色譜條件［6-7］AichromBond-SB 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-水（32 ∶68）；增益 150；漂移管溫度 85 ℃；氣體壓力25 psi（1 psi=6.895 kPa）；噴霧器溫度 36 ℃；體積流量 1 mL／min；柱溫 30 ℃。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 黃芪甲苷HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of astragaloside A

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成 0.559 6 mg／mL 溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 精密吸取不同時(shí)間點(diǎn)提取液各 15 mL，按照 2015年版 《中國(guó)藥典》［8-9］方法制備，即得。

2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取 “2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，甲醇定容至1 mL，搖勻，在 “2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測(cè)定。以黃芪甲苷進(jìn)樣量對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（X），峰面積對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y=1.657 3X-0.197 9（r=0.999 5），在559.58～5 595.8 ng 范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2 毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷含有量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 SunFire?C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.2% 甲酸（18 ∶82）；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；體積流量1 mL／min；柱溫25 ℃。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of calycosin-7-O-β-D-glucoside

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品適量，加甲醇制成0.110 9 mg／mL 溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 量取不同時(shí)間點(diǎn)提取液各 1 mL，過(guò)濾，即得。

2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取 “2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，甲醇定容至1 mL，搖勻，在 “2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣 4 μL 測(cè)定。以毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y=7 270X-2 310（r=0.999 9），在44.36～443.6 ng 范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3 黃芪多糖含有量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，加水制成96 ng／mL 溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液制備 精密量取不同時(shí)間點(diǎn)提取液適量，置于200 mL 量瓶中，加水定容，搖勻，即得。

2.3.3 最大吸收波長(zhǎng)確定 精密量取對(duì)照品、供試品溶液各1 mL，置于10 mL 具塞試管中，苯酚-硫酸法［10-11］顯色后在 200～700 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)。結(jié)果，2種溶液在486 nm 波長(zhǎng)處均有最大吸收，故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、0.9 mL，置于具塞試管中，加水至1.0 mL，按 “2.3.3”項(xiàng)下方法處理，以相應(yīng)溶劑為空白，于486 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為A= 0.064 7X＋0.034 5（r=0.999 5），在 2.7～12.3 ng／mL 范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.4 藥材提取和指標(biāo)測(cè)定 稱(chēng)取藥材200 g，加入一定體積水加熱回流提取4 h，按預(yù)先設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)取樣，靜置至常溫后 3 000 r／min 離心 15 min 去除雜質(zhì)，25 ℃恒溫下測(cè)定提取液電導(dǎo)率，HPLCDAD 法測(cè)定黃芪甲苷含有量，HPLC-PAD 法測(cè)定毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷含有量，紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定黃芪多糖含有量。

2.5 黃芪指標(biāo)成分提取規(guī)律及終點(diǎn)表征 采用電導(dǎo)率測(cè)定法，按 “2.4”項(xiàng)下結(jié)果繪制電導(dǎo)率-時(shí)間、指標(biāo)成分含有量-時(shí)間曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3～5。由圖可知，隨著提取時(shí)間增加，電導(dǎo)率、指標(biāo)成分含有量變化具有相同規(guī)律，均先快速增長(zhǎng)，再趨于平穩(wěn)，最后達(dá)到恒定，即在提取過(guò)程中的前40 min快速增長(zhǎng)，40～200 min 內(nèi)緩慢增長(zhǎng)，趨于平穩(wěn)，200 min 后達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，即在200 min 時(shí)提取液中電導(dǎo)率與指標(biāo)成分含有量均無(wú)明顯變化，表明黃芪指標(biāo)成分提取過(guò)程達(dá)到終點(diǎn)。

圖3 電導(dǎo)率、黃芪甲苷含有量隨提取時(shí)間的變化Fig.3 Variations of conductivity and astragaloside A content with extraction time

2.6 電導(dǎo)率與黃芪指標(biāo)成分含有量之間的定量關(guān)系 基于 “2.5”項(xiàng)下結(jié)果，繪制以指標(biāo)成分含有量為橫坐標(biāo)，提取液電導(dǎo)率為縱坐標(biāo)的關(guān)系曲線(xiàn)（圖6），并對(duì)其進(jìn)行線(xiàn)性相關(guān)考察，發(fā)現(xiàn)電導(dǎo)率與黃芪甲苷、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、黃芪多糖含有量關(guān)系曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.991 9、0.985 4、0.986 8，均呈現(xiàn)出良好的相關(guān)性。

圖4 電導(dǎo)率、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷含有量隨提取時(shí)間的變化Fig.4 Variations of conductivity and calycosin-7-O-β-D-glucoside content with extraction time

圖5 電導(dǎo)率、黃芪多糖含有量隨提取時(shí)間的變化Fig.5 Variations of conductivity and Astragali Radix polysaccharides content with extraction time

圖6 電導(dǎo)率與黃芪甲苷（A）、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（B）、黃芪多糖（C）含有量之間的關(guān)系Fig.6 Relationships between conductivity and contents of astragaloside A（A），calycosin-7-O-β-D-glucoside（B）and Astragali Radix polysaccharides（C）

3 討論

純水中本無(wú)電導(dǎo)率，而在提取過(guò)程中黃芪細(xì)胞中含有的皂苷、黃酮、多糖、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)等成分可透過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)向水中擴(kuò)散，并以鹽的形式存在，使得水顯示電信號(hào)［12］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著提取時(shí)間增加，提取液中電導(dǎo)率與黃芪指標(biāo)成分（黃芪甲苷、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、黃芪多糖）含有量的變化趨勢(shì)均是先快速增長(zhǎng)后趨于平穩(wěn)，線(xiàn)性關(guān)系良好，故電導(dǎo)率測(cè)定法可及時(shí)快速、準(zhǔn)確直觀(guān)地反饋上述成分提取過(guò)程和終點(diǎn)，解決了常規(guī)HPLC 法、紫外-可見(jiàn)分光光度法等存在的樣品處理方法復(fù)雜、步驟繁多、耗時(shí)長(zhǎng)、反饋信號(hào)延后等問(wèn)題。

另外，通過(guò)關(guān)聯(lián)黃芪提取液中電導(dǎo)率與指標(biāo)成分含有量之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在提取過(guò)程中可采用電導(dǎo)率測(cè)定法反饋后者變化規(guī)律，并及時(shí)指示提取終點(diǎn)，而且該方法同樣適用于苦參、紅花、側(cè)柏葉、梔子、全蝎、土鱉蟲(chóng)類(lèi)等藥材指標(biāo)成分的提?。?2-15］，可為中藥提取過(guò)程控制提供更多選擇。