陳海青 周 璇 王秀秀

高尿酸血癥是由于人體內(nèi)尿酸的合成增加或排出減少等原因引起的一種代謝性疾病，最主要的危害是引起痛風(fēng)。越來(lái)越多的研究表明高尿酸血癥與痛風(fēng)、高血壓、慢性腎臟病、肥胖、糖尿病、腦卒中等代謝性疾病密切相關(guān)。隨著人們生活習(xí)慣的改變，我國(guó)高尿酸血癥逐年上升，特別是在沿海地區(qū)，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。目前降尿酸的藥物主要有黃嘌呤氧化酶抑制劑、尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑和重組尿酸酶補(bǔ)充劑等，例如秋水仙堿、糖皮質(zhì)激素和別嘌醇等，但對(duì)肝腎毒性較大。隨著中藥的發(fā)展，利用中藥治療高尿酸血癥的研究越來(lái)越來(lái)多，中藥越來(lái)越成為療效確切、安全性高的降尿酸藥物[1,2]。

槲皮素是一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物，廣泛存在于各種植物性食物中，具有抗氧化、抗炎等生物活性。已有大量研究表明槲皮素具有降尿酸、治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用[3]。但對(duì)于槲皮素降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的機(jī)制探究少有報(bào)道。本研究旨在通過(guò)采用尿酸酶敲除建立穩(wěn)定的小鼠高尿酸血癥模型，研究槲皮素降低血清尿酸水平的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尿酸酶基因敲除小鼠，雄性，體質(zhì)量(24±2)g;購(gòu)自南方動(dòng)物模式中心。以正常野生型大小一致的雄性小鼠為對(duì)照。分籠飼養(yǎng)，保持室溫25 ℃，通風(fēng)良好，自然光照，正常飲食飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 藥品與試劑槲皮素(上海將來(lái)實(shí)業(yè)有限公司，純度98%，批號(hào):A007353-50 g)。Trizol(Thermo Scientific 公司)；PMSF(Sigma-Aldrich 公司)；蛋白裂解液(碧云天)；BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific 公司)；GLUT9、ABCG2、URAT1抗體購(gòu)置abcam公司。引物均有生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及取材將SPF級(jí)雄性小鼠分為野生型對(duì)照組(wt)、高尿酸模型組(HUA)，及槲皮素低、中、高劑量組(100、200、400 mg /kg)組，每組8只。鑒定出高尿酸血癥小鼠純合子第5周起，給小鼠灌胃對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度槲皮素溶液，每日1 次，連續(xù)2周。灌胃2周后，內(nèi)眥取血。頸椎脫位處死小鼠;取腎臟及回腸、空腸放于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè)取血于3500 r·min-1離心10 min，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、總膽固醇(TC)、血糖(Glu)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的濃度。取出肝臟組織加組織裂解液制備成肝組織勻漿液，高速離心，取上清液用BCA法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)腎臟、回腸、空腸中尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT9、ABCG2、URAT1的表達(dá)。利用Trizol提取腎臟、回腸和空腸中總RNA放于紫外分光度計(jì)上檢測(cè) RNA 的濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明建立 20 μl 反應(yīng)體系：6 μl DEPC 水，0.5 μl RNA 酶抑制劑，2 μl 隨機(jī)引物，2 μl總RNA，將20 μl反應(yīng)溶液放于37 ℃水浴鍋中保溫60 min合成cDNA。利用 SYBR Green 染料，采用兩步法設(shè)置程序：95 ℃、5 min，預(yù)變性；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，置于ABl7500 PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)腎臟、回腸、空腸中尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA的表達(dá)情況。利用 Primer Priemer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物。引物如下：URAT1:F 5’-ATGGCTGGGTTTACGACCAC-’3,R 5’- GCCCAAACCTATCTGAGGCA-’3；GLUT9：F 5’-CTTCCTGTGGACTCTGCCTC-’3,R5’-GACGAGCGAGAAGGACCATT-’3；ABCG2：F 5’-TCTCAACTCCACTGCAAGC-’3,R 5’-ACGTGGTCATTACTGGAAGACA-’3；OAT1：F 5’-GCAGCCTATGCACCCAACTA-’3，R5’-AACTGGCCCAAGCTGTAGAC-’3；OAT2：F 5’-ACCCTGGTTGGGTACCTGAT-’3，R5’-AGAAGCCATCGTGCAGACTC-’3；OAT2：F 5’-TAAAACAACCCTTTGGCGGC-’3，R5’- GAGCTGGATTCAGTTGGGCT-’3。結(jié)果分析：采用ΔΔCt法分析每個(gè)基因的Ct值，以?xún)?nèi)參 GAPDH為對(duì)照值，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算后得出結(jié)果，與對(duì)照組比較，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4 蛋白印記檢測(cè)腎臟、腸道中尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCG2表達(dá)將組織切成小塊，按每 100 mg 組織加入 1 ml含1% PMSF的RIPA裂解液冰上研磨勻漿，14000 rpm離心15 min，取上清，BCA 法測(cè)定蛋白含量。按1∶4比例加上蛋白上樣緩沖液，金屬浴加熱煮沸 10 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，將膠上蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF 膜。將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF 膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h,孵育兔抗ABCG2、GLUT9和UART1一抗2 h，在辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗反應(yīng)液37 ℃孵育1 h，ECL 顯色后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，通過(guò) Image.Pro Plus 軟件分析與內(nèi)參條帶的灰度值比值，比較各組差異。

1.2.5 ELISA試劑盒測(cè)定肝臟中黃嘌呤氧化酶活性取肝臟組織，按每100 mg組織加入1 ml含1% PMSF的RIPA裂解液，冰上研磨勻漿，14000 rpm離心15 min，取上清，加到96孔板中，在相同緩沖液中加入18 μl 15 μm黃嘌呤引發(fā)反應(yīng)，在加入底物緩沖液后，立即測(cè)量37 ℃反應(yīng)30 min在295 nm的吸光度?；谀蛩針?biāo)準(zhǔn)曲線，從吸光度增加30 min計(jì)算尿酸產(chǎn)量。用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定肝勻漿中的蛋白質(zhì)濃度。XO活性表示為每分鐘每毫克蛋白質(zhì)產(chǎn)生的尿酸含量。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)高尿酸血癥小鼠血清生化指標(biāo)影響與正常組相比，高尿酸血癥組血清UA、Cr、BUN顯著升高(P<0.05)，這表明高尿酸血癥模型造模成功。此外，高尿酸血癥小鼠LDL含量也升高，但甘油三酯和葡萄糖含量沒(méi)有明顯變化。與高尿酸血癥小鼠相比，400 mg/kg體質(zhì)量的槲皮素注射顯著抑制血清UA濃度，血清肌酐與尿素氮水平也降低，并且呈劑量依賴(lài)性。但不同濃度的槲皮素對(duì)甘油三酯和葡萄糖水平影響不明顯。見(jiàn)圖1。

注：矩形條及其誤差條分別代表平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)。與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與高尿酸血癥組相比，#P<0.05，## P<0.01圖1 槲皮素對(duì)高尿酸血癥小鼠血清生化指標(biāo)影響

2.2 槲皮素對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性的影響我們進(jìn)一步檢測(cè)了腎臟黃嘌呤氧化酶活性變化，黃嘌呤氧化酶在UA合成中起重要作用。與正常對(duì)照相比，高尿酸血癥肝臟黃嘌呤氧化酶活性顯著升高(P<0.05)。與高尿酸血癥模型組相比，高濃度槲皮素顯著降低了黃嘌呤氧化酶的活性，但低濃度和中濃度的槲皮素對(duì)黃嘌呤氧化酶活性無(wú)顯著影響。見(jiàn)圖2。

2.3 槲皮素對(duì)小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA的影響與對(duì)照組比較，模型組小鼠腎臟GLUT9和 URAT1 mRNA顯著升高(P<0.01)，而轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCG2 mRNA顯著降低，OAT1、OAT2和OAT3無(wú)顯著變化。與模型組比較，槲皮素高、中劑量可恢復(fù)高尿酸血癥小鼠腎臟降低的ABCG2 mRNA(P<0.01)，降低GLUT9mRNA 表達(dá)，對(duì)URAT1、OAT1、OAT2和OAT3mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖3。

注：矩形條及其誤差條分別代表平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)。與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與高尿酸血癥組相比，#P<0.05，##P<0.01圖2 槲皮素對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性的影響

注：矩形條及其誤差條分別代表平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)。與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與高尿酸血癥組相比，#P<0.05，##P <0.01圖3 槲皮素對(duì)高尿酸血癥小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)的影響

2.4 槲皮素對(duì)小鼠小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT9、URAT1和ABCG2表達(dá)水平的影響通過(guò)蛋白印記，我們進(jìn)一步檢測(cè)了槲皮素對(duì)小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT9、URAT1和ABCG2表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，與模型組對(duì)比，高濃度的槲皮素顯著降低了GLUT9和URAT1的表達(dá)，低、中濃度對(duì)GLUT9和URAT1的表達(dá)無(wú)顯著影響。中、高濃度的槲皮素顯著增加了ABCG2的表達(dá)。見(jiàn)圖4。

注：矩形條及其誤差條分別代表平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)。與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與高尿酸血癥組相比，#P<0.05，## P<0.01圖4 槲皮素對(duì)小鼠小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT9、URAT1和ABCG2表達(dá)水平的影響

2.5 槲皮素對(duì)小鼠腸道轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT9、URAT1和ABCG2 mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，高尿酸模型組腸道轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCG2表達(dá)明顯下降，GLUT9升高，URAT1無(wú)明顯變化。而與高尿酸血癥模型組相比，槲皮素高劑量組顯著提高了ABCG2 表達(dá)水平，降低了GLUT9的表達(dá)，而對(duì)URAT1無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖5。

注：矩形條及其誤差條分別代表平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)。與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與高尿酸血癥組相比，#P<0.05，##P<0.01圖5 槲皮素對(duì)小鼠腸道轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT9、URAT1和ABCG2 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

高尿酸血癥是人類(lèi)最常見(jiàn)的代謝紊亂病之一，最常見(jiàn)的是導(dǎo)致痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和尿酸腎結(jié)石。高尿酸血癥也與高血壓和高脂血癥、糖尿病和肥胖的發(fā)展有關(guān)。尿酸水平是預(yù)防痛風(fēng)和其他疾病的關(guān)鍵因素。在過(guò)去的幾年中，大量學(xué)者對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇降尿酸作用越來(lái)越感興趣。然而別嘌呤醇具有誘發(fā)過(guò)敏綜合征，Stevens-Johnson綜合征、腎毒性等不良作用。一些植物化學(xué)物質(zhì)如黃酮類(lèi)化合物因其具有天然的黃嘌呤氧化酶抑制特性，并對(duì)高尿酸血癥一些并發(fā)癥具有的保護(hù)作用而受到重視[4]。槲皮素是水果和蔬菜中的主要黃酮醇，在蘋(píng)果、葡萄、漿果、紅洋蔥、西蘭花等植物中含量豐富。作為有效的抗氧化劑，槲皮素的生物活性包括抗癌劑、抗炎性和預(yù)防視網(wǎng)膜變性等已被大量研究。盡管大量研究表明槲皮素通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶活性降低血尿酸作用[5]，但機(jī)制仍不清楚，特別是槲皮素對(duì)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因敲除建立高尿酸模型小鼠，發(fā)現(xiàn)槲皮素能降低血尿酸水平，其機(jī)制可能通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟、腸道中尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCG2和GLUT9來(lái)降尿酸的。

尿酸酶(Uox)是尿酸分解的關(guān)鍵酶，尿酸酶敲除會(huì)導(dǎo)致尿酸分解異常，進(jìn)而導(dǎo)致高尿酸。我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)，獲得Uox基因敲除的雜合子小鼠，通過(guò)雜合子交配，獲得Uox基因敲除純合子小鼠。我們的結(jié)果表明這種基因敲除的小鼠尿酸明顯高于正常組。相對(duì)于其他建模方法如抑制尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能、增加尿酸前體物質(zhì)攝入、抑制尿酸酶功能等，基因敲除建模更加穩(wěn)定，也更有利于研究藥物對(duì)尿酸排泄的作用機(jī)制。給小鼠定期注射槲皮素2周后，能顯著降低血清尿酸水平，并且與槲皮素呈劑量依賴(lài)型。此外，高劑量槲皮素也能顯著降低尿酸氮、肌酐的含量，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。之前很多研究也表明槲皮素能降尿酸，和我們的研究一致[6]。

高尿酸血癥90%以上是因尿酸排泄減少所致，腎臟為尿酸排泄的主要器官，由位于腎小管上皮細(xì)胞的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共同協(xié)調(diào)完成。按照功能不同可分為重吸收相關(guān)蛋白、排泄相關(guān)蛋白和骨架蛋白。這些尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是高尿酸血癥和其他代謝紊亂的紐帶，也是新型降尿酸藥物的研究靶點(diǎn)[7]。其中重吸收和排泄相關(guān)蛋白一直是研究的熱點(diǎn)，在治療高尿酸血癥中起著重要的作用。腎臟中的尿酸處理非常復(fù)雜，涉及腎小球?yàn)V過(guò)，腎小管重吸收和分泌。位于近端腎小管細(xì)胞頂端和基底外側(cè)膜的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URATI和GLUT9分別參與腎臟對(duì)尿酸的重吸收。大量研究表明URAT1、GLUT9L基因敲除小鼠的尿酸排泄顯著增加[8～12]。我們研究中發(fā)現(xiàn)，高劑量槲皮素能顯著降低GLUT9的表達(dá)，而對(duì)URAT1轉(zhuǎn)錄沒(méi)有明顯影響。有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括OAT1、OAT2和OAT3雖然也對(duì)尿酸鹽的攝取有關(guān)[13～15]，但在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，高尿酸血癥小鼠組及槲皮素處理組對(duì)OAT1、OAT2和OAT3沒(méi)有明顯影響。而在腎臟中尿酸排泄相關(guān)蛋白ATP 結(jié)合盒蛋白家族G 蛋白亞家族成員2(ABCG2)明顯受槲皮素的影響，并且呈劑量依賴(lài)性，這在蛋白和mRNA水平上都得到驗(yàn)證。ABCG2在腎臟和腸道中均大量表達(dá)，位于上皮細(xì)胞的管腔側(cè)膜，與尿酸排泄具有重要的關(guān)系[16]。ABCG2表達(dá)降低不僅會(huì)影響腎臟排泄尿酸的能力，還會(huì)降低腸道尿酸排泄，繼而加重腎臟的尿酸負(fù)荷，導(dǎo)致腎臟損傷。以ABCG2為藥物靶點(diǎn)的藥物越來(lái)越受到重視，提高ABCG2在腸道的表達(dá)，可減輕腎臟排尿酸負(fù)荷，避免腎小管功能受損。小腸是許多類(lèi)黃酮糖苷的主要吸收位點(diǎn)，可以在腸的不同部位被吸收。我們的研究表明槲皮素不僅可以影響腎臟中的轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，還可以降低腸道中GLUT9表達(dá)，增加ABCG2的表達(dá)，增加尿酸的排泄，起到雙向降尿酸的作用。

總之，槲皮素可明顯降低高尿酸血癥大鼠血清尿酸水平，其降尿酸機(jī)制是通過(guò)降低腎臟和腸道尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT9，增加ABCG2表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

(本文校對(duì)：周金榮 收稿日期2019-01-25)