范 興， 安 昌， 陳 鳴， 楊成梓， 黃德福?

（1. 福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院， 福建 福州 350025； 2. 福建中醫(yī)藥大學藥學院， 福建 福州 350122）

肝寶膠囊為福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院名老中醫(yī)的臨床經(jīng)驗方， 是由青果、 虎杖、 谷芽、 麥芽、萊菔子組成的純中藥制劑， 適用于脂肪肝及急、 慢性肝炎之肝熱積滯證[1-4］， 臨床上應用近20 年， 療效確切。 但肝寶膠囊現(xiàn)行質量標準不全面， 僅采用TLC 法定性鑒別大黃素， 并且尚無相應指標性成分的含有量測定， 無法客觀反映其內在質量。 為了更有效地控制肝寶膠囊質量， 保證各批次間穩(wěn)定性和臨床療效， 本實驗建立該制劑HPLC 指紋圖譜， 并測定其中5 種成分的含有量[5-6］， 以期為其質量控制提供實驗依據(jù)。

1材料

1.1 儀器 LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）； KQ-250E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； 電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］； Milli-Q 型超純水機（美國密理博公司）。

1.2 試藥 沒食子酸（批號Y09A7Y17058） 對照品購自上海源葉生物科技有限公司， 含有量≥98%； 芥子堿硫氰酸鹽（批號111702-200501）、 虎杖苷 （批號111575-200502）、 白藜蘆醇 （批號111535-200502）、 大黃素 （批號110756-200110）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院， 含有量均≥98%。 13 批肝寶膠囊由福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院制劑室制備（每粒裝0.34 g， 批號161108、161219、 161226、 170218、 170222、 170302、170304、 170308、 170319、 170321、 170324、170401、 170504， 編號S1～S13）。 青果、 虎杖、 谷芽、 麥芽、 萊菔子購自福建省藥材有限公司， 經(jīng)福建中醫(yī)藥大學楊成梓教授鑒定均為正品， 均符合2015 年版《中國藥典》 一部相關項下規(guī)定。 甲醇、乙腈為色譜純； 其他試劑均為分析純； 水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Platisil-C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動相乙腈-0.1%磷酸， 梯度洗脫（0～5 min， 3%乙腈； 5 ～10 min， 3%→12%乙腈； 10 ～20 min， 12% 乙腈； 20 ～70 min， 12% →35% 乙 腈； 70 ～75 min， 35% →65% 乙 腈； 75 ～90 min， 65% →70% 乙腈）； 體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃； 檢測波長305 nm； 進樣量7 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、 芥子堿硫氰酸鹽、 虎杖苷、 白藜蘆醇、 大黃素對照品適量， 置于棕色量瓶中， 甲醇制成質量濃度分別為537.93、 284.43、 2 312.57、 52.98、 105.03 μg／mL的溶液， 即得。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取膠囊內容物約0.34 g， 置于具塞錐形瓶中， 精密加入20 mL 甲醇， 密塞， 稱定質量， 超聲 （250 W、 40 kHz）30 min， 放冷， 甲醇補足減失的質量， 搖勻， 濾過， 取續(xù)濾液， 0.45 μm 微孔濾膜過濾， 即得。

2.4 單味藥與陰性樣品溶液制備 按處方比例及工藝， 分別制備缺青果、 虎杖、 萊菔子的陰性樣品， 按“2.3” 項下方法制備， 即得。

2.5 HPLC 指紋圖譜

2.5.1 精密度試驗 取膠囊內容物（編號S6），按“2.3” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次， 以11 號峰（虎杖苷） 為參照峰， 測得各共有峰相對保留時間RSD均小于0.32%， 相對峰面積RSD 均小于1.59%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取膠囊內容物（編號S6），按“2.3” 項下方法制備供試品溶液， 于0、 2、 4、8、 12、 24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，以11 號峰（虎杖苷） 為參照峰， 測得各共有峰相對保留時間RSD 均小于0.32%， 相對峰面積RSD均小于1.59%， 表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復性試驗 取膠囊內容物（編號S6），按“2.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定， 以11 號峰（虎杖苷） 為參照峰， 測得各共有峰相對保留時間RSD均小于0.32%， 相對峰面積RSD 均小于1.91%，表明該方法重復性良好。

2.6 建立方法

2.6.1 相似度評價 取膠囊內容物（編號S1 ～S13）， 按“2.3” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定， 結果見圖1， 共標定出19 個共有峰， 由于11 號峰（虎杖苷） 峰面積較大， 峰形良好， 出峰時間較穩(wěn)定， 故選擇其作為參照峰（S）。 然后， 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2004A 版） 進行分析， 以S6為參照峰進行色譜峰自動匹配， 采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜， 測得13 批樣品相似度分別為0.987、 0.985、 0.999、 0.992、 0.990、 0.997、0.998、 0.997、 0.987、 0.986、 0.993、 0.998、0.994， 均大于0.9， 表明各批次樣品之間的質量相對穩(wěn)定。

2.6.2 共有峰指認歸屬 通過各峰保留時間、紫外光譜圖信息并結合對照品， 確認出其中5 個色譜峰， 分別為4 號峰沒食子酸、 7 號峰芥子堿硫氰酸鹽、 11 號峰虎杖苷、 16 號峰白藜蘆醇、19 號峰大黃素。 然后， 將各單味藥材、 陰性對照圖譜、 肝寶膠囊指紋圖譜進行比對， 確認了19個共有峰主要來自青果、 虎杖、 萊菔子， 其中1 ～6、 8 ～10 號峰來自青果， 11、 14 ～19 號峰來自虎杖， 7、 13 號峰來自萊菔子， 12 號峰來自青果和萊菔子， 見圖2。

圖1 13 批肝寶膠囊HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of thirteen batches of Ganbao Capsules

圖2 各樣品共有峰HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of common peaks of various samples

2.7 含有量測定

2.7.1 專屬性試驗 精密吸取對照品、 供試品、陰性樣品溶液， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定， 結果見圖3。 由圖可知， 陰性樣品在對照品相應保留時間處無色譜峰， 表明對測定無干擾， 方法專屬性良好。

圖3 各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.7.2 線性關系考察 精密吸取對照品溶液0.3、0.9、 1.5、 2.1、 2.7、 3.3 mL， 置于25 mL 棕色量瓶中， 甲醇稀釋至刻度， 搖勻， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。 以進樣量為橫坐標（X）， 峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸， 得方程分別為沒食子酸Y=1 201.9X-24 152 （r=0.999 4）、 芥子堿硫氰酸鹽Y=1 329.9X-18 648 （r=0.999 6）、 虎杖苷Y=4 943.5X-385 062 （r=0.999 5）、 白藜蘆醇Y=6 437.2X ＋7 355.9 （r = 0.999 6）、 大黃素Y =2 116.4X-10 507 （r=0.999 6）， 分別在45.19 ～497.05、 23.89 ～ 262.81、 194.26 ～ 2 136.81、4.45～48.95、 8.82 ～97.05 ng 范圍內線性關系良好。

2.7.3 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次， 測得沒食子酸、 芥子堿硫氰酸鹽、 虎杖苷、 白藜蘆醇、 大黃素峰面積RSD 分別為0.71%、 0.82%、 0.78%、0.98%、 0.93%， 表明儀器精密度良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（編號S6）， 于0、 2、 4、 8、 12、 24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定， 測得沒食子酸、 芥子堿硫氰酸鹽、 虎杖苷、 白藜蘆醇、 大黃素峰面積RSD分別為1.06%、 1.21%、 0.96%、 1.32%、 1.17%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.7.5 重復性試驗 精密稱取膠囊內容物（編號S6） 6 份， 按“2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定， 測得沒食子酸、 芥子堿硫氰酸鹽、 虎杖苷、 白藜蘆醇、 大黃素含有 量 RSD 分 別 為 1.17%、 1.58%、 1.22%、1.76%、 1.63%， 表明該方法重復性良好。

2.7.6 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的膠囊（編號S6） 9 份， 每份約0.17 g， 平均分成3組， 以80%、 100%、 120%水平分別精密加入對照品溶液[沒食子酸（537.93 μg／mL） 0.60、 0.75、0.90 mL， 芥 子 堿 硫 氰 酸 鹽 （284.43 μg／mL）0.69、 0.86、 1.03 mL， 虎杖苷（2 312.57 μg／mL）0.28、 0.35、 0.42 mL， 白藜蘆醇（52.98 μg／mL）0.50、 0.62、 0.74 mL， 大黃素（105.03 μg／mL）0.72、 0.90、 1.08 mL］， 按“2.3” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、 芥子堿硫氰酸鹽、 虎杖苷、 白藜蘆醇、 大黃素平均加樣回收率分別為99.85%、99.46%、 99.97%、 98.95%、 99.67%， RSD 分別為1.56%、 1.98%、 1.42%、 2.13%、 2.01%。

2.7.7 樣品含有量測定 取13 批膠囊， 按“2.3” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定， 計算含有量， 結果見表1。

3 討論

3.1 指標成分選擇 肝寶膠囊中青果、 虎杖同為君藥， 其中前者清熱解毒， 利咽生津， 主要活性成分沒食子酸具有明顯保肝、 抗肝纖維化作用[7-10］，而后者利濕退黃， 清熱解毒， 散瘀止痛， 止咳化痰， 主要活性成分虎杖苷、 白藜蘆醇、 大黃素可對脂肪肝起到較好的改善作用[11-15］； 萊菔子為佐使藥， 消食除脹， 降氣化痰， 能調節(jié)脾胃之氣機，芥子堿硫氰酸鹽為其有效成分之一。 因此， 本實驗選擇沒食子酸、 芥子堿硫氰酸鹽、 虎杖苷、 白藜蘆醇和大黃素作為肝寶膠囊含有量測定的指標成分。

表1 各成分含有量測定結果（n=3）Tab.1 Results of content determination of various constituents （n=3）

3.2 提取條件選擇 本實驗比較了不同提取溶劑（70%乙醇、 70%甲醇、 甲醇、 純水）， 發(fā)現(xiàn)甲醇提取效果較優(yōu)， 此時各成分響應較完全， 色譜基線穩(wěn)定。 然后， 比較了不同提取方法（超聲、 回流）及提取時間（20、 30、 40 min）， 發(fā)現(xiàn)甲醇超聲提取30 min 時提取率較高， 可提取完全。

3.3 色譜條件選擇 本實驗比較了不同流動相（甲醇-0.1%磷酸、 乙腈-0.1%磷酸、 乙腈-3%冰醋酸、 乙腈-水）， 發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫時分離效果最好。 為了使各成分均有較好響應， 本實驗比較了不同檢測波長（254、 270、 305、 326 nm），發(fā)現(xiàn)在305 nm 處色譜峰較多， 峰形較好， 同時各成分均有吸收， 分離度理想。