姚 欣， 黎彧利， 朱艮苗

(重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 重慶 401320)

結(jié)核病( Tuberculosis，TB) 是對(duì)人類健康最具威脅性和挑戰(zhàn)性的感染性疾病之一，是各國關(guān)注的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題[1]。世界衛(wèi)生組織稱，2015年全世界報(bào)告了1 040萬新結(jié)核病例[2]。隨著治療藥物的應(yīng)用，結(jié)核分枝桿菌出現(xiàn)耐藥性的現(xiàn)象越來越多，其獲得耐藥性有2個(gè)主要因素：一為獲得性基因突變，二為外排泵的激活。常見的結(jié)核耐藥相關(guān)基因有利福平相關(guān)(rpoB)、異煙肼相關(guān)(katG、inhA)、乙胺丁醇相關(guān)(embABC)、吡嗪酰胺相關(guān)(pncA)、鏈霉素相關(guān)(rpsL、rrs)、氟喹諾酮相關(guān)(gyrA、gyrB)。檢測(cè)方法主要有 Xpert MTB/RIF 檢測(cè)系統(tǒng)、探針雜交技術(shù)和高分辨率熔解曲線技術(shù)等[3]。本研究利用高分辨率熔解曲線(HRM)技術(shù)分析結(jié)核病患者耐藥性，旨在為獲得更準(zhǔn)確更快速的臨床檢驗(yàn)報(bào)告提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集選取2017年1月-2018年6月重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院確診為肺結(jié)核病的患者痰樣本250份。患者平均年齡為(52.4±14.2)歲，其中男性185例，女性65例，所有患者均為初治。按照臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程留取合格痰標(biāo)本。

1.2 涂片鏡檢根據(jù)人民衛(wèi)生出版社第5版《臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)》[4]規(guī)定在100個(gè)觀察視野中存在1～9個(gè)分枝桿菌為1+；10個(gè)觀察視野中存在1～9個(gè)分枝桿菌為2+；每個(gè)觀察視野中存在1～9個(gè)分枝桿菌為3+；每個(gè)觀察視野中存在>9個(gè)分枝桿菌為4+。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)將痰標(biāo)本用4% NaOH處理20～30 min，以去除雜菌。將處理后的標(biāo)本接種于羅琴培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8周，觀察出現(xiàn)典型灰白色顆粒狀、干燥的菌落且抗酸染色為陽性者為培養(yǎng)成功。

1.4 細(xì)菌耐藥性從固體培養(yǎng)基上的分枝桿菌中分離菌株，在肉湯中進(jìn)行接種，并在37℃下孵育7 d。細(xì)菌生長后，在鹽水吐溫-80溶液中制備稀釋液，并用Middlebrook 7H10培養(yǎng)基鋪板，在37℃下培養(yǎng)21 d。異煙肼(INH)使用0.2 μg/ mL和1.0 μg/mL的濃度，利福平(RIF)使用1.0 μg/mL的濃度。通過計(jì)數(shù)對(duì)照板(H37Rv)上的菌落對(duì)含有藥物的平板進(jìn)行平板讀數(shù)。耐藥百分比 =(含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù))/(對(duì)照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù))×50%。若耐藥百分比≥1%，則認(rèn)為受試菌對(duì)該藥耐藥(R)，<1%判斷為敏感(S)。

1.6 熔解曲線分析引物序列如表1所示。在以下條件進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR(Rotor Gene Q，德國 QIAGEN 公司)：95℃變性10 min，95℃1 min，55℃30 s，72℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后在72℃下延伸7 min。高分辨率熔解曲線分析在55℃～85℃的溫度范圍進(jìn)行，增量為0.02℃。將H37Rv菌株的DNA用作參照，并在實(shí)時(shí)PCR后分析解鏈曲線，以鑒定與rpoB、katG和inhA啟動(dòng)子區(qū)域基因中的RIF和INH抗性相關(guān)的突變區(qū)域。具有與H37Rv類似的分化曲線譜的痰樣品被認(rèn)為對(duì)特定藥物敏感。相反，具有除H37Rv之外的分化曲線譜的痰樣品被認(rèn)為對(duì)特定藥物具有抗性。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,評(píng)估熔解曲線分析的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測(cè)值(PPV)和陰性預(yù)測(cè)值(NPV)并制成四格表。

2 結(jié)果

2.1 表型特征及耐藥性根據(jù)涂片鏡檢的分枝桿菌數(shù)量，將樣本分為4類：1+21份，2+72份，3+76份，4+81份，單藥耐藥和多藥耐藥性結(jié)果見表2。

表2 表型特征及耐藥性/例

注：MDR為多藥耐藥。

2.2 耐藥熔解曲線分析在具有已知表型譜的250個(gè)痰標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)99個(gè)圖譜與對(duì)照有差異，為RIF耐藥，101個(gè)圖譜與對(duì)照有差異，為INH耐藥。觀察到的分化曲線具有敏感和耐藥部分(圖1)。

2.3 熔解曲線與瓊脂平板對(duì)耐藥性分析結(jié)果高分辨率熔解曲線分析發(fā)現(xiàn)對(duì)RIF耐藥99例，INH耐藥101例，MDR 89例。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示RIF耐藥93例，INH耐藥102例，MDR 69例(表3)。高分辨率熔解曲線診斷RIF耐藥、INH耐藥和MDR耐藥的靈敏度分別為90.3%、90.2%、89.9%，特異性為90.4%、93.9%、90.6%。

表3 熔解曲線與瓊脂平板對(duì)耐藥性分析/例

注：R：耐藥；S：敏感；HRM：高分辨率熔解曲線；RIF：利福平；INH：異煙肼；MDR：多重耐藥。

2.4 涂片結(jié)果與HRM分析多重耐藥性的關(guān)系根據(jù)涂片鏡檢的結(jié)果將涂片分級(jí)，分級(jí)后的HRM對(duì)多重耐藥性的診斷靈敏度、特異性、PPV、NPV結(jié)果見表4。對(duì)于涂片為4+的標(biāo)本，HRM診斷的靈敏度、特異性、PPV和NPV均最高，而1+最低，說明細(xì)菌數(shù)量越多，HRM診斷多重耐藥性越可靠。

表4 MDR檢測(cè)的熔解曲線和瓊脂平板比例分析中的診斷參數(shù)

注：HRM為高分辨率熔解曲線，APP為瓊脂平板。

3 討論

本研究利用高分辨率熔解曲線檢測(cè)痰液中結(jié)核分枝桿菌的耐藥性,結(jié)果顯示，對(duì)于單藥RIF或INH的耐藥性分析的靈敏度和特異性均高于90%，而對(duì)于多重耐藥性的診斷則此參數(shù)稍有下降?？赡茉蚴菍?duì)于單個(gè)藥物的耐藥性分析時(shí)，高分辨率熔解曲線有明確的對(duì)照比較，通過圖譜清晰區(qū)分耐藥個(gè)體，而其中有假陽性或假陰性的存在，所以在預(yù)測(cè)多重耐藥性時(shí)，假陰性和假陽性的疊加，使得多重耐藥MDR型診斷的靈敏度和特異性比單獨(dú)基因型低。由本研究結(jié)果可知，多重耐藥MDR型的靈敏度與特異性分別為89.9%和90.6%，因此對(duì)于多重耐藥性的診斷也具有一定的可靠性和實(shí)用性。

本研究觀察到不同涂片的結(jié)果與其HRM分析的靈敏度、特異性、PPV和NPV也有所不同。與涂片1+、2+和3+相比，4+樣本的敏感性和特異性更高。楊彩虹等[5]研究結(jié)果顯示，高分辨率溶解曲線用于結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥性的檢測(cè)具有較好的靈敏度，耗時(shí)短，在異煙肼耐藥結(jié)核病的快速診斷方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值，與本研究結(jié)果基本一致。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步細(xì)化了對(duì)于不同涂片結(jié)果，高分辨率熔解曲線診斷耐藥性的靈敏度與特異性等。對(duì)于涂片結(jié)果菌數(shù)較多的標(biāo)本，利用高分辨率熔解曲線可以快速準(zhǔn)確地確定耐藥結(jié)果，從而提高診斷效率；對(duì)于涂片菌數(shù)較少的標(biāo)本，不建議將高分辨率熔解曲線分析做首選，應(yīng)以傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)為主，而高分辨率熔解曲線可作為輔助診斷?；趓poB、katG基因和inhA啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析診斷結(jié)核桿菌多重耐藥性可作為篩選試驗(yàn)。

在國內(nèi)外已經(jīng)使用商業(yè)試劑盒基因型MTBDRplus的分子方法，其結(jié)合了常規(guī)多重PCR和硝酸纖維條帶中的反向雜交，但該方法復(fù)雜[6]。在分子方法中，其他方法的成本較高，因此熔解曲線的分析是診斷的理想選擇。 通過實(shí)時(shí)PCR在痰樣品中進(jìn)行MDR-TB，不但可以在24 h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果回報(bào)并且成本低廉，結(jié)果也易于解釋。

Galarza等[7]研究顯示，MDR-TB檢測(cè)靈敏度和特異性大于90%，并發(fā)現(xiàn)與rpoB、katG和inhA基因相關(guān)的最常見突變是S531L、S315T1和C-15T。Tavakkoliamol等[8]通過熔解曲線分析了2 000份陽性痰標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變檢測(cè)靈敏度為98.6%，特異性為100.0%，與本研究結(jié)果相似。 Anthwal等[9]分析了124份痰標(biāo)本，在基因rpoB、katG和啟動(dòng)子區(qū)域inhA其敏感度分別為89.0%、85.0%、100.0%，所有基因的特異性均為100.0%。

DNA質(zhì)量影響敏感性和耐藥性熔解曲線的區(qū)分。 與傳統(tǒng)方法(例如樣品煮沸或基于樹脂的純化)相比，用商業(yè)試劑盒純化DNA能夠充分地區(qū)分敏感性和耐藥性2種熔解曲線[10-13]。此外，從痰液樣品中提取的DNA，往往包含結(jié)核分枝桿菌以及人體中的DNA，因此有必要對(duì)DNA進(jìn)行優(yōu)化。

總之，熔解曲線的分析對(duì)痰標(biāo)本中MDR-TB的快速診斷具有較高的靈敏性和特異性，能夠基于特定基因鑒定抗藥性突變。使用該方法作為結(jié)核病耐藥型診斷的附加篩查試驗(yàn)，成本低、易于解釋，且需要較少的診斷時(shí)間。