酈娟，董華夏，張珣，涂鳳琴，戴小芳，曾慧君，胡筱靜，楊永

（武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，湖北 武漢 430012）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），又稱綠膿桿菌，是一種非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌，在土壤、水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道中廣泛存在，被世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）的危害分析關(guān)鍵控制點(diǎn)（hazard analysis critical control point，HACCP）評(píng)估為嬰兒瓶裝飲用水的危害指示菌[1]。銅綠假單胞菌在桶裝飲用水中的污染屢見報(bào)道，已逐漸成為桶裝飲用水質(zhì)量不合格的主要指標(biāo)。

對(duì)致病菌進(jìn)行分型分析，對(duì)污染源的識(shí)別和污染途徑的追蹤有重要意義。分子分型技術(shù)已成為致病菌分型的重要手段[2]。常見的方法有基于脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）水平差別，例如脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）、多為點(diǎn)序列測(cè)定（multi-locus sequence typing，MLST）、隨機(jī)擴(kuò)增DNA 多態(tài)性（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）和核糖體分型（ribotyping）等方法[3-5]。近年來，基于蛋白質(zhì)差別的分型技術(shù)也發(fā)展起來，例如基于基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）技術(shù)和表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（surface enhanced laser desorption/ionization time of flight，SELDI-TOF MS）技術(shù)的方法[6-7]。

對(duì)本地生產(chǎn)的82 批次桶裝水進(jìn)行銅綠假單胞菌檢測(cè)，初步了解桶裝水中銅綠假單胞菌的污染情況，并對(duì)分離出的銅綠假單胞菌采用核糖體分型和基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜技術(shù)的方法進(jìn)行分型分析，可建立桶裝飲用水中銅綠假單胞菌數(shù)據(jù)庫，為桶裝水中銅綠假單胞菌的污染溯源積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CN 瓊脂、金氏B 瓊脂、乙酰胺肉湯和綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基：購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Riboprinter 系統(tǒng)EcoRⅠ試劑套裝、Riboprinter 系統(tǒng)樣品制備包：購自美國(guó)杜邦公司；三氟乙酸（色譜純）、乙腈（色譜純）：購自賽默飛世爾科技有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA），細(xì)菌實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品：購自德國(guó)布魯克公司；VITEK2 GN 鑒定卡：購自生物梅里埃公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-1300ⅡA2 生物安全柜：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；VITEK2 compact system 全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)：梅里埃公司；SPX-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Riboprinter 全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)：美國(guó)杜邦公司；基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜 MALDI-TOF-MS/MS（autoflex speed）：德國(guó)布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法

按照GB 19298-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)包裝飲用水》[8]規(guī)定，采用GB/T 8538—2008《飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》[9]中4.54 礦泉水中銅綠假單胞菌的檢測(cè)方法。分離株用VITEK2 compact system 進(jìn)行確認(rèn)。

分離株經(jīng)革蘭氏染色后，根據(jù)染色結(jié)果選用鑒定卡按VITEK2 compact system 儀器操作說明進(jìn)行生化鑒定。經(jīng)過確認(rèn)的分離株用于分型分析。將分離株在CN 平板上劃線，（36±1）℃培養(yǎng) 48 h。

1.3.3 核糖體分型

按照杜邦Riboprinter 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)操作程序進(jìn)行。

將Riboprinter 生成的指紋圖譜與Riboprinter 數(shù)據(jù)庫比對(duì)。再將圖譜導(dǎo)入BioNumerics 軟件包，用UPGMA 法進(jìn)行聚類分析，Pearson 相關(guān)系數(shù)為1%。

1.3.4 MALDI-TOF MS 分型

樣品制備。用滅菌牙簽刮取單菌落少量菌體，在靶板的靶點(diǎn)內(nèi)涂成薄層。在其上覆蓋1 μL HCCA 溶液，自然晾干。

儀器參數(shù)：線性正離子（LP）采集模式；加速電壓：19.50 kV；檢測(cè)分子質(zhì)量范圍2 000 Da～20 000 Da，激光頻率為500 Hz。每次試驗(yàn)之前都用標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行質(zhì)量校正。用Flex Control 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，用Biotyper 和FlexAnalysis 軟件進(jìn)行后續(xù)聚類分析。

采用電抗子模塊分段投切的模塊化多電平換流器降電容方法//李鈺,李帥,趙成勇,許建中,曹均正//(19):90

按照Biotyper 軟件使用說明，鑒定結(jié)果與銅綠假單胞菌匹配分?jǐn)?shù)為1.700 以上的，為銅綠假單胞菌。進(jìn)一步確認(rèn)后的菌株蛋白質(zhì)指紋圖用FlexAnalysis 軟件分析，相似性判定水平為50%。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠假單胞菌的檢測(cè)結(jié)果

在2016年桶裝飲用水82 批次樣品中18 批次檢出銅綠假單胞菌，檢出率為22.0%，各季度結(jié)果見表1。

表1 2016年各季度桶裝飲水中銅綠假單胞菌檢出率Table 1 Detection rate of Pseudomonas aeruginosa in bottled drinking water in 2016

表1 每個(gè)批次檢測(cè)5個(gè)樣品，每批次檢出銅綠假單胞菌的樣品數(shù)范圍在1～4，樣品中銅綠假單胞菌計(jì)數(shù)范圍在1 CFU/250 mL～320 CFU/250 mL，具體見表2。

表2 各批次中銅綠假單胞菌計(jì)數(shù)情況Table 2 Counting of Pseudomonas aeruginosa in batchs

續(xù)表2 各批次中銅綠假單胞菌計(jì)數(shù)情況Continue table 2 Counting of Pseudomonas aeruginosa in batchs

2.2 銅綠假單胞菌的核糖體分型結(jié)果

將從樣品中分離得到的36 株銅綠假單胞菌用杜邦Riboprinter 全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)進(jìn)行核糖體分型，鑒定結(jié)果均為銅綠假單胞菌。用BioNumerics 軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果分為2個(gè)大群，其中1群包括16 株，2 群包括20 株，每群再分為了2個(gè)亞群。結(jié)果見圖1。

圖1 36 株銅綠假單胞菌分離株核糖體分型結(jié)果Fig.1 Clustering of ribosome typing of 36 Pseudomonas aeruginosa

2.3 銅綠假單胞菌的MALDI-TOF MS分型

將從樣品中分離得到的36 株銅綠假單胞菌用進(jìn)行MALDI-TOF MS 分型，通過對(duì)蛋白質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行聚類分析，按照50%相似性作為判定水平，36 株菌可被分為2個(gè)大群，其中1 群包含16個(gè)菌株，2 群包含20個(gè)菌株，其中1 群又分為2個(gè)亞群，分別包含8個(gè)菌株，結(jié)果見圖2。

圖2 36 株桶裝水來源的銅綠假單胞菌MALDI-TOF MS 分型結(jié)果Fig.2 Clustering of typing analysis of 36 Pseudomonas aeruginosa by MALDI-TOF MS

2.4 兩種分型結(jié)果的比較

2.4.1 比較來源于同一批次的不同樣品中分離出的菌株的分型結(jié)果

來源于同批次樣品的菌株632-19-S-1、632-19-S-3 和 632-19-S-5，核糖體分型和 MALDI-TOF MS 分型都被歸為同一亞群。但在核糖體分型中632-19-S-1和632-19-S-5 更相似，而在MALDI-TOF MS 分型中632-19-S-1 和 632-19-S-3 更相似。

來源于同批次樣品的菌株632-18-S-1、632-18-S-2、632-18-S-3 和632-18-S-4 在兩種分型分析中也都?xì)w在了同一亞群。在核糖體分型中632-18-S-1 和632-18-S-4 更相似，632-18-S-2 和 632-18-S-3 更相似。而在 MALDI-TOF MS 分型中，632-18-S-1 和 632-18-S-2 更相似，632-18-S-3 和 632-18-S-4 更相似。

來源于同批次樣品的菌株632-17-S-8、632-20-S-3 和632-20-S-4 在兩種分型分析中也都?xì)w在了同一亞群。在核糖體分型中632-20-S-3 和632-20-S-4更為相似，而在MALDI-TOF MS 分型中632-17-S-8和632-20-S-4 更為相似。

來源于同批次樣品的菌株632-19-S-7、632-19-S-8 和 632-20-S-2。在核糖體分型中，632-19-S-7 和一 632-19-S-8 歸為 1個(gè)亞群，632-20-S-2 歸為另一個(gè)亞群。在MALDI-TOF MS 分型中，3個(gè)菌株分為同一亞群，其中632-19-S-7 和632-19-S-8 更為相似。

2.4.2 比較來源同一生產(chǎn)廠家的不同批次樣品中分離出來的菌株的分型結(jié)果

菌株 632-17-S-1、632-17-S-2、632-17-S-3、632-17-S-4 和 632-17-S-6、632-17-S-7 來自同一生產(chǎn)廠家不同批次。在核糖體分型中，4個(gè)菌株歸為同一亞群。在MALDI-TOF MS 分型中，632-17-S-7 和其他3個(gè)菌株歸在一個(gè)大群下的兩個(gè)不同亞群。

菌株 632-18-S-5、632-18-S-6、632-18-S-7、632-18-S-8 和 632-21-S-3、632-21-S-4 來源于另一廠家的不同批次樣品。在核糖體分型中，632-21-S-4與其他菌株歸在不同大群，632-18-S-5 和632-21-S-3 與 632-18-S-6、632-18-S-7 和 632-18-S-8 歸在同一大群的兩個(gè)亞群。在MALDI-TOF MS 分型中，632-21-S-3 和其他菌株分在不同亞群。

可見，核糖體分型和MALDI-TOF MS 分型的結(jié)果不完全一致，可能是因?yàn)楹颂求w分型針對(duì)的是DNA 水平，與酶切和電泳情況有關(guān)，而MALDI-TOF MS 分型針對(duì)的是蛋白質(zhì)水平，與菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)。

3 討論

在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)將銅綠假單胞菌列為包裝飲用水的致病菌檢測(cè)指標(biāo)之一后，桶裝飲用水中銅綠假單胞菌的污染情況日益受到重視。很多地區(qū)的桶裝飲用水中銅綠假單胞菌的污染率在8%以上[10-13]，此次調(diào)查中銅綠假單胞菌的檢出率為22.0%，污染情況同樣不容忽視。其中第3 和第4 季度的檢出率明顯高于第1 和第2 季度，與之前其他研究者的研究結(jié)論一致[10]。每批次檢出的陽性樣品數(shù)均小于5，說明生產(chǎn)中銅綠假單胞菌的污染具有不均一性和隨機(jī)性。銅綠假單胞菌已成為桶裝水的重大安全隱患。

銅綠假單胞菌的污染源很多。水源水污染、制水過程中的過濾、反滲透設(shè)施、貯水罐和管道等消毒不徹底和交叉污染、回收空桶及蓋清洗消毒不到位和桶蓋密封不嚴(yán)都有可能是銅綠假單胞菌污染的途徑[14]。對(duì)銅綠假單胞菌的分型分析，可以進(jìn)一步了解銅綠假單胞菌的污染程度和污染來源，實(shí)現(xiàn)污染溯源，便于污染的消除和預(yù)防，有利于桶裝水生產(chǎn)企業(yè)的規(guī)范生產(chǎn)。脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）是目前公認(rèn)的病原菌分子分型和溯源研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是其操作比較復(fù)雜，對(duì)技術(shù)人員要求較高[15]。而核糖體分型目前已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化[16-17]，MALDI-TOF MS分型的操作也相對(duì)簡(jiǎn)單[6]，對(duì)于致病菌的分型和污染溯源具有重大意義。后期結(jié)合分型結(jié)果，建立地區(qū)銅綠假單胞菌數(shù)據(jù)庫，可以為桶裝水中銅綠假單胞菌的污染溯源積累數(shù)據(jù)，為后續(xù)桶裝水中銅綠假單胞菌的防控提供技術(shù)支持。