郝曉華，高改利，曹麗蓉，原庭玉，鞏瑞蘭

(忻州師范學(xué)院 生物系，山西 忻州 034300)

知母(AnemarrhenaRhizome)：百合科植物,具較強(qiáng)抗旱抗寒能力，是荒原山區(qū)的重要綠化品種.知母根莖烘干切片后可入藥，又稱“地參”.植株可直接用于外感熱病、清熱鎮(zhèn)咳、腸燥便秘[1]等癥.根莖具有防止血小板凝集、解熱、降低轉(zhuǎn)氨酶活性等多種藥理功能[2-4].黃酮類化合物(flavonoids)又名維生素P[5]，具很好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值.其表現(xiàn)出良好的藥理功能，如降低血液黏度、減少血栓的凝集和血脂的形成、抗氧化、防衰老、消炎、止痛、殺菌等[6-8]，是一種具有極大實(shí)際應(yīng)用前景的天然抗氧化物.

知母中甾體皂苷類、多糖類、黃酮類等活性物質(zhì)含量豐富[2].多數(shù)文獻(xiàn)側(cè)重于知母多糖類和皂苷類成分的提取分離與純化，關(guān)于知母根莖中總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究目前還鮮有報(bào)道，因此，很有必要對(duì)知母中黃酮類物質(zhì)的提取工藝與其抗氧化活性進(jìn)行探究.

超聲波輔助法是常用的提取細(xì)胞內(nèi)容物的方法，具有省時(shí)、高效、低成本、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[9-10].本文通過(guò)正交法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)知母黃酮進(jìn)行抗氧化性研究，為進(jìn)一步地研究知母中總黃酮的功效以及合理利用知母藥材資源與開發(fā)黃酮類制品提供部分參考.

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

所用材料為知母根莖，2017年6月購(gòu)自五臺(tái)山大藥房，干燥烘干，用組織粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目標(biāo)準(zhǔn)篩去除大顆粒性雜質(zhì)備用.

1.2 儀器與試劑

AL204高精密電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；LC-4016低速臺(tái)式離心機(jī)：安徽中科儀器有限公司；KQ3200DV超聲波清洗器：浙江賽德儀器有限公司；723PC紫外-可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；SHB-III標(biāo)準(zhǔn)型雙表循環(huán)水式真空泵：天津賽得利儀器有限公司.

蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)：北京酷爾化學(xué)科技有限公司；95%乙醇、七水合硫酸亞鐵、水楊酸、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、過(guò)氧化氫、氫氧化鈉、抗壞血酸，超純水，所用藥品與試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[11]

參照秦明有的方法，本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置蘆丁濃度為0-0.08 mg/mL等8個(gè)濃度梯度，5%亞硝酸鈉-4%氫氧化鈉-10%硝酸鋁-70%乙醇混合液為反應(yīng)顯色劑并且當(dāng)作對(duì)照溶液，在510 nm下測(cè)定吸光度OD值，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定三次后取算術(shù)平均值.

1.3.2 知母總黃酮提取工藝流程

知母根莖→干燥→粉碎過(guò)篩→加入乙醇提取液→超聲波提取→水浴→離心→二次提取→合并上清液減壓抽濾并脫色→濃縮→定容→510 nm處測(cè)吸光值.

精密稱量已干燥過(guò)篩的知母粉末1.00 g于500 mL燒杯中；按一定料液比加入一定體積的70%乙醇，超聲波輔助浸提一定時(shí)間，后于70 ℃的水浴鍋中加熱0.5 h，4 200 r/min離心15 min取上清液，沉淀加提取劑重復(fù)上述步驟進(jìn)行二次提取，合并上清液后加少量活性炭減壓抽濾得黃酮提取液母液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將母液濃縮至50 mL，取2 mL加顯色劑并定容至10 mL后于510 nm處測(cè)定吸光值.

1.3.3 總黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)

按照1.3.2的方法，設(shè)置料液比(1:10～1:60g/mL)，超聲提取時(shí)間(15～90 min)，超聲功率(75～150 W)，超聲溫度(40～90 ℃)，考察它們對(duì)知母總黃酮提取率的影響，進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí)每個(gè)因素設(shè)置6個(gè)實(shí)驗(yàn)水平，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定3次取平均值.按照1.3.4節(jié)中的方法計(jì)算黃酮萃取率.

1.3.4 總黃酮提取率的計(jì)算

知母總黃酮提取率的計(jì)算公式：

提取率/%=(C×V1×V)/(M×V2)×10-3×100%

式中：C為黃酮質(zhì)量濃度(g/mL)

V為母液總體積(50 mL)；

V1為待測(cè)液的體積(10 mL)；

V2為母液分取的體積(2 mL)；

M為知母粉末的質(zhì)量(1.00 g).

1.3.5 知母總黃酮提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別從4個(gè)因素的6個(gè)水平中篩選出3個(gè)較優(yōu)水平作為考察對(duì)象，開展優(yōu)化實(shí)驗(yàn).

用SPSS 20.0軟件設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，見表1.參照正交設(shè)計(jì)表中的組合進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，測(cè)定提取率，優(yōu)選最佳組合.

表1 知母總黃酮提取工藝L9(34)因素水平表

1.4 抗氧化能力測(cè)定

1.4.1 DPPH·清除能力的測(cè)定

參照周寧[12]等人方法，將知母總黃酮提取液稀釋成不同濃度梯度(5,15,25,35,45 μg/mL)的樣品液，按下列組合分別加入各個(gè)試劑，混勻.按下式計(jì)算DPPH·清除率：

DPPH·清除率/%=[A0-(A-A1)]/A0×100%.

A:1 mL樣液+3 mLDPPH溶液.

A1:1 mL樣液+3 mL無(wú)水乙醇.

A0:1 mL蒸餾水+3 mLDPPH溶液.

將抗壞血酸配制成與總黃酮相同濃度梯度的樣液，測(cè)定Vc的DPPH·清除率.

1.4.2 對(duì)羥基自由基(·OH)清除能力的測(cè)定

參考楊喆等的方法[13-15]，將總黃酮提取液稀釋成一系列濃度梯度(2，4，6，8，10 mg/mL)的溶液，抗壞血酸配成相同濃度梯度的溶液.向試管中順次加入各個(gè)反應(yīng)液，充分混勻.按下列公式計(jì)算·OH清除率：

·OH清除率/%=[A0-(A-A1)]/A0×100%.

A：實(shí)驗(yàn)組吸光度.

A1：對(duì)照組吸光度.

A0：為試劑本底吸光度.

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

見圖1，縱坐標(biāo)為吸光度OD值，橫坐標(biāo)為黃酮質(zhì)量濃度，得線性回歸方程為y=12.907x+0.002 5，回歸系數(shù)為R2=0.999 1的標(biāo)準(zhǔn)曲線.在濃度為0-0.07 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)提取率的影響

圖2所示為料液比對(duì)黃酮萃取得率的影響.總黃酮提取率先升后降.這是因?yàn)殡S著料液比增大，細(xì)胞壁外滲透壓升高，黃酮相對(duì)濃度降低，利于細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)的浸出，但料液比大于1∶40后，細(xì)胞內(nèi)非黃酮類雜質(zhì)溶出量增加，導(dǎo)致提取率下降，乙醇溶劑浪費(fèi).故選擇1∶20，1∶30，1∶40這三個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn).

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖3所示為超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響.總黃酮提取率隨超聲時(shí)間的增加變化趨勢(shì)為先上升后下降.隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞破碎率和總黃酮溶出量都增加，到45 min時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)黃酮浸出率與雜質(zhì)浸出率基本達(dá)到平衡.超過(guò)45 min后，由于超聲波對(duì)黃酮結(jié)構(gòu)有破壞作用，雜質(zhì)浸出較多，目標(biāo)產(chǎn)物提取率減小.且抽提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易造成溶液粘稠度增大，抽濾難度增加，故選擇30 min，45 min，60 min三個(gè)水平做正交試驗(yàn).

圖2 不同料液比對(duì)總黃酮提取率的影響圖3 總黃酮提取率隨超聲時(shí)間的影響

2.2.3 超聲功率對(duì)提取率的影響

圖4所示為不同超聲功率對(duì)提取率的影響.總黃酮提取率隨著超聲功率的增大逐漸上升，120 W以后黃酮溶出增加速率開始降低，此時(shí)超聲功率對(duì)提取率的影響開始減弱.由于實(shí)驗(yàn)中儀器限制，最大功率只能達(dá)到150 W,故選擇超聲功率120 W，135 W，150 W作為正交試驗(yàn)的三個(gè)水平.

2.2.4 超聲溫度對(duì)提取率的影響

圖5為超聲溫度對(duì)提取率的影響.總黃酮提取率隨超聲溫度的升高先上升后下降，在40 ℃-60 ℃范圍內(nèi)，提取率上升較快，這是因?yàn)楦邷丶涌旆肿踊顒?dòng)，使黃酮浸出速度加快.而大于60 ℃以后，提取率反而下降，這是因?yàn)槟承S酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)在過(guò)高溫的環(huán)境中容易發(fā)生分解，且高溫下多糖類物質(zhì)分解速度和浸出速度加快，使細(xì)胞外液中雜質(zhì)含量增多.所以選擇50 ℃,60 ℃,70 ℃三個(gè)溫度水平作正交試驗(yàn).

圖4 不同超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響圖5 不同超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

2.3 總黃酮提取工藝的正交設(shè)計(jì)及結(jié)果

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以4因素料液比(A)、超聲時(shí)間(B)、超聲功率(C)、超聲溫度(D)為考察對(duì)象，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表.正交設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，正交方差分析見表3.

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

注：R的數(shù)值越大表明該因素的水平變動(dòng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響效果越明顯.

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

注：P<0.01則表示極顯著；0.010.05則表示不顯著.

由正交試驗(yàn)結(jié)果表中R值可知，各因素對(duì)提取率的影響程度依次為：料液比>超聲功率>超聲溫度>超聲時(shí)間,因素A(料液比)的極差(R)高達(dá)0.97，其對(duì)知母總黃酮提取率的影響最大.因素C(超聲功率)的極差是0.63，其對(duì)知母總黃酮提取率的影響較大.因素B(超聲時(shí)間)和D(超聲溫度)的極差分別為0.29，0.32，它們對(duì)提取率的影響差不多，在4因素中較小.通過(guò)比較k值可知，因素A與因素C的水平3為最優(yōu)，B與D的水平2最優(yōu).由方差分析表可知，液料比的P=0.007<0.01，對(duì)黃酮提取得率的影響極顯著.超聲功率的P值0.010.05，對(duì)黃酮得率沒有顯著影響.綜合上述，可以確定總黃酮提取的最佳工藝條件為A3B2C3D2，即料液比1∶40 g/mL、超聲時(shí)間45 min、超聲功率150 W、超聲溫度60 ℃.對(duì)該實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行檢驗(yàn)以考察該工藝是否為最佳提取條件.

2.4 正交結(jié)果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取知母粉末3份各1.00 g，按工藝條件A3B2C3D2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定提取率，重復(fù)測(cè)定3次，得提取率分別為1.52%，1.55%，1.53%.總黃酮提取率相近，無(wú)顯著差異，且平均值1.53%高于正交設(shè)計(jì)表中的最高值，說(shuō)明工藝穩(wěn)定可靠，正交試驗(yàn)結(jié)果可信.

2.5 總黃酮抗氧化性結(jié)果

2.5.1 清除DPPH·實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖6分析可知，知母總黃酮對(duì)DPPH·具有顯著清除能力，其對(duì)DPPH·的清除率隨質(zhì)量濃度的增大不斷增強(qiáng).雖然在相同條件下知母總黃酮對(duì)DPPH·的清除能力始終略低于同濃度的Vc，但當(dāng)其質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)清除率達(dá)50.7%，濃度為45 μg/mL時(shí)其清除率可達(dá)76.5%，其清除能力幾乎等同于抗壞血酸.此后，清除率基本保持穩(wěn)定.表明知母總黃酮對(duì)DPPH·有較好的清除作用.

2.5.2 清除·OH實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖7分析可知，知母總黃酮清除·OH的能力與質(zhì)量濃度基本呈正相關(guān)，清除率隨質(zhì)量濃度的增大不斷增強(qiáng).總黃酮量為10 μg/mL時(shí)自由基清除率就可達(dá)到60.2%，在相同濃度下，總黃酮對(duì)自由基清除率的增加趨勢(shì)與抗壞血酸的自由基清除率增加趨勢(shì)基本相同，但總黃酮對(duì)·OH的清除能力始終低于抗壞血酸.

圖6 知母總黃酮與抗壞血酸清除DPPH·能力比較圖7 知母總黃酮與抗壞血酸清除·OH能力比較

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助乙醇溶劑法提取知母根莖中總黃酮，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳提取工藝.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，總黃酮提取的最佳工藝條件為料液比1∶40 g/mL、超聲時(shí)間45 min、超聲功率150 W、超聲溫度60 ℃.該工藝下平均提取率達(dá)到1.53%，即提取量為15.30 mg/g.正交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)提取率分別為1.52%，1.55%，1.53%，相差不大，說(shuō)明該正交結(jié)果穩(wěn)定可靠.抗氧化能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大，對(duì)DPPH·與·OH的清除能力都逐漸增強(qiáng)，其抗氧化能力與濃度基本呈正相關(guān)，雖與抗壞血酸相比其抗氧化性略差，但知母總黃酮仍具有良好的自由基清除能力.