付建平，陳丹婷，趙 昕，劉 毅

(江西師范大學 生命科學學院，江西 南昌 330022 )

干擾素(IFN)是一類具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調節(jié)等功能的多效細胞因子，其分泌受干擾素調節(jié)因子(IRF)家族調節(jié)[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，干擾素調節(jié)因子家族有11個成員，即IRF1～IRF11。根據(jù)其系統(tǒng)進化分析顯示IRF家族可以分為4個亞家族，即IRF1、IRF3、IRF4和IRF5亞家族，其中IRF4、IRF8、IRF9、IRF10基因隸屬IRF4亞家族[4]。

IRF4基因僅表達于免疫相關細胞如淋巴細胞、巨噬細胞、B細胞和樹突狀細胞，在先天性免疫和特異性免疫中發(fā)揮重要作用[5-6]。其本身與DNA的親和力弱，當與其他轉錄因子形成復合物后，其結合效率顯著增強。IRF4與轉錄因子PU.1形成異源二聚體與免疫球蛋白G基因的增強子結合后，能激活B細胞中免疫球蛋白輕鏈的表達；IRF4可促進B淋巴細胞向漿細胞分化，在B細胞和T細胞成熟及樹突狀細胞發(fā)育過程中扮演著十分重要的角色。IRF4基因不表達或者功能缺陷將導致免疫缺陷，機體無法產(chǎn)生抗體。IRF4還與許多淋巴樣惡性腫瘤疾病、自身免疫相關疾病等相關[7-8]。在魚類中，IRF4可被細菌、細菌模擬物脂多糖、病毒和病毒模擬物聚肌胞苷酸誘導，暗示著IRF4在抗細菌、病毒等先天性免疫反應中起重要作用[9-12]。然而爬行動物中IRF4基因的功能仍不清楚。筆者通過研究中華鱉(Pelodiscussinensis)IRF4基因的表達規(guī)律及構建過表達質粒，初步探討其免疫功能，為了解IRF4免疫應答機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞系與病毒

中華鱉(體質量約100 g)購自江西南昌向塘中華鱉養(yǎng)殖場，在實驗室內(nèi)暫養(yǎng)7 d，水溫(28±1) ℃，投喂商品顆粒飼料2次/d；鯉魚表皮瘤細胞系和中華鱉肌肉來源細胞[13]分別用含10%胎牛血清的199、DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)進行傳代培養(yǎng)(28 ℃)；中華鱉虹彩病毒(Soft-shelledturtleiridovirus, STIV)源自深圳出入境檢驗檢疫局。

1.2 中華鱉IRF4基因序列獲取、分析及真核表達載體構建

取中華鱉脾臟于1 mL Trizol(Invitrogen)中，參照說明書提取總RNA。取1 μg總RNA用去除DNA污染的逆轉錄試劑盒(Takara)制備cDNA模板。反應步驟如下：先將RNA用基因組DNA消化酶于42 ℃消化2 min去除基因組(反應體系為：基因組DNA消化酶1 μL，5×基因組DNA消化酶緩沖液2 μL，RNA 1 μg，H2O補齊到10 μL)，然后加入反轉錄混合物(PrimeScript RT Enzyme Mix 1,1 μL，RT Primer Mix，1 μL，5×PrimeScript Buffer，4 μL，H2O，4 μL)于37 ℃逆轉錄15 min后85 ℃失活5 s，最后4 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank中中華鱉IRF4基因序列信息，用Primer 5.0軟件設計并合成特異性引物IRF4-F和IRF4-R(全文所用引物信息見表1)以擴增IRF4基因編碼區(qū)，其擴增體系(50 μL)為：H2O，40 μL；10×Blend Taq polymerase buffer，5 μL；上下游引物(10 μmol/L)各1 μL；2.5 mmol/L dNTPs，2 μL；Blend Taq polymerase，0.5 μL；上述cDNA模板，0.5 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，目的片段經(jīng)回收后連入pMD18-T載體，轉化至大腸桿菌(Escherichiacoli)(Top10)感受態(tài)細胞，陽性克隆pMD18T-IRF4送生工生物工程(上海)股份有限公司測序并分析。通過美國國立生物技術信息中心上同源搜索IRF4基因序列，利用Clustal X 2.1進行多序列比對分析其保守位點及結構等分析。以pMD18T-IRF4為模板，用引物IRF4-F-NotⅠ和IRF4-R-BglⅡ進行PCR擴增，將回收的目的片段和質粒p3xflag-CMV14分別用NotⅠ和BglⅡ雙酶切，連接，轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，將其命名為p3xflag-IRF4，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。所有轉染用的質粒用去內(nèi)毒素質粒小提試劑盒(Omega)提取，用微量紫外—可見分光光度計(Nanodrop 2000)測定含量。

表1 中華鱉IRF4基因克隆和表達分析所用引物

1.3 中華鱉IRF4基因組織分布

為了研究IRF4基因在健康中華鱉組織及器官中的分布，分別取3只中華鱉的脾、腎、肝、腸、心、肌肉、肺、血液于1 mL Trizol中，提取RNA，同上述方法制備cDNA模板。設計熒光定量引物IRF4-rqF/IRF4-rqR，用SYBR?Premix TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)(Takara)在ABI7500儀器上進行熒光定量。其反應體系為：Premix Ex Taq Ⅱ(2×)，6 μL，正向和反向引物各0.4 μmol/L，cDNA模板，0.5 μL，Rox Reference Dye(50×)，0.24 μL，用H2O補齊至12 μL；反應程序為：95 ℃預變性10 min，然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共45個循環(huán)，反應結束后確認其擴增曲線和溶解曲線。試驗結束后，以β-actin做內(nèi)參，參照2-△△Ct方法[14]分析IRF4基因在不同組織及器官中的相對表達分布。

1.4 中華鱉外周血淋巴細胞中IRF4基因誘導表達

分別自3只中華鱉頸靜脈采抗凝血2 mL，用RPMI1640(含2%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素0.1 mg/mL)(Gibco)稀釋5倍，加入到含有5 mL Ficoll plus 1.083(Solarbio)分離液上方，室溫，1200 r/min，離心15 min，收集淋巴細胞。用培養(yǎng)基洗滌細胞2次后，用RPMI1640(含10% FBS，青霉素100 U/mL，鏈霉素0.1 mg/mL)重懸，以每孔4×106細胞量(接種量2 mL)接種于12孔細胞培養(yǎng)板中(NEST)。28 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)2 h后，分別加入PBS(對照組)，100 μg/mL脂多糖(L2880，Sigma),100 μg/mL聚肌胞苷酸(P3350，Sigma),12、24 h后收集細胞。同上述方法制備cDNA模板，熒光定量檢測其表達變化。用獨立樣本t檢驗分析其差異是否顯著,P<0.05表示差異顯著。

1.5 IRF4影響中華鱉肌肉來源細胞對中華鱉虹彩病毒的敏感性

將中華鱉肌肉來源細胞以每孔0.5×104細胞量接種于96孔細胞培養(yǎng)板中(NEST)，48 h后，用脂質體2000(Invitrogen)分別將0.1 μg p3xflag-cmv14和p3xflag-IRF4質粒轉染到每孔細胞中。48 h后感染中華鱉虹彩病毒，計算半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量(TCID50)。方法如下：用不含血清的DMEM/F12按2倍稀釋8個梯度，接種于上述轉染后細胞，每孔100 μL，每個梯度接種6孔，吸附1 h后換成含2%胎牛血清的DMEM/F12維持液，于培養(yǎng)箱觀察并記錄細胞病變情況，當細胞病變不再發(fā)展時，用Reed-Munch方法[15]計算半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量。試驗設3次重復,用獨立樣本t檢驗分析試驗組與對照組之間是否存在差異,P<0.05表示差異顯著。為了確保融合蛋白IRF4-flag在中華鱉肌肉來源細胞中表達，同時將1×105細胞量的中華鱉肌肉來源細胞接種于直徑為30 mm的細胞培養(yǎng)皿中(NEST)，48 h后用脂質體2000分別將2 μg的p3xflag-cmv14和p3xflag-IRF4質粒轉染到細胞中。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用50 μL的RIPA裂解液裂解細胞，用Flag標簽抗體(小鼠單抗，碧云天，AF519)通過蛋白質印跡法檢測其表達。

1.6 IRF4對干擾素信號通路及NF-κB信號通路的影響

為了探討過表達IRF4能否調節(jié)干擾素信號通路及NF-κB信號通路，將鯉魚(Cyprinuscarpio)表皮瘤細胞以每孔0.5×105細胞量種于24孔細胞培養(yǎng)板中(NEST)，24 h后用脂質體2000分別將p3xflag-cmv14/p3xflag-IRF4(0.25 μg)、pIFNpro-Luc/pNF-κB-Luc(0.25 μg)、pRLTK(0.025 μg)質粒共轉染至每孔細胞中。48 h后用PBS洗滌細胞1次，加入新鮮配制的1×被動裂解液(100 μL/孔)，室溫裂解細胞15 min，將裂解液轉入干凈的離心管短暫離心，取20 μL上清液用來檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活力，計算其比值。所用試劑盒為雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega)，儀器為Glomax 2020。每個樣品3個重復，用獨立樣本t檢驗分析試驗組與對照組之間是否存在差異，P<0.05表示差異顯著。另外，收集轉染上述不同質粒細胞，同上述方法用蛋白質印跡法檢測融合蛋白IRF4-flag表達。

2 結 果

2.1 IRF4基因的擴增及序列分析

以中華鱉脾臟cDNA為模板進行PCR擴增，獲得片段大小約1600 bp。將此特異性基因片段克隆入pMD18-T載體并進行測序鑒定，其和GenBank中預測的中華鱉IRF4基因的開放讀碼框一致性達到100%。開放讀碼框長為1341 bp，編碼446個氨基酸，預測其蛋白分子量為51.25 ku。和其他脊椎動物IRF4基因一樣，中華鱉IRF4基因含有1個DNA結合結構域(DBD)和1個IRF相關結構域(IAD)，其中DNA結構域中含有5個保守的色氨酸殘基，中華鱉IRF4和雞的相似性最高，達96%(圖1)。

2.2 中華鱉IRF4基因在各組織及器官中表達

熒光定量結果顯示，IRF4基因泛表達于所檢測的組織及器官中，其中血液中表達最高，肝和脾次之(圖2)。

2.3 脂多糖和聚肌胞苷酸誘導外周血淋巴細胞中IRF4表達

熒光定量結果顯示，脂多糖和聚肌胞苷酸均能誘導外周血淋巴細胞中IRF4基因上調表達，其中IRF4基因的表達在脂多糖誘導12、24 h后分別上調6.9倍和10.6倍，聚肌胞苷酸誘導后上調10.6倍和25.3倍(圖3)。

2.4 過表達IRF4降低中華鱉肌肉來源細胞對中華鱉虹彩病毒敏感性

為了檢驗其是否具有抗病毒功能，測定了中華鱉虹彩病毒對轉染p3xflagcmv14或p3xflagIRF4質粒后中華鱉肌肉來源細胞的半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量，結果顯示，中華鱉肌肉來源細胞中過表達IRF4基因后其半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量為2-5.1/0.1 mL，是對照組的4.8倍(2-7.33/0.1 mL)(圖4a)。同時蛋白質印跡法結果確定融合蛋白IRF4-flag(54.7 ku，其中標簽約3.4 ku)成功表達于中華鱉肌肉來源細胞中(圖4b)。

2.5 過表達IRF4對干擾素、NF-κB通路影響

利用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測其對干擾素啟動子、NF-κB啟動子活性的作用，結果顯示，中華鱉IRF4顯著誘導干擾素啟動子活性的作用，與對照組相比，其啟動子被激活2.6倍(圖5a)。過表達IRF4后，其能顯著抑制NF-κB啟動子活性(圖5b)。同時，蛋白質印跡法結果確定IRF4-flag融合蛋白成功表達于鯉魚表皮瘤細胞中(圖5c)。

圖1 IRF4基因氨基酸序列多重比對通過Clustal X 2.1進行多重比對分析，相同(*)和相似(.或：)氨基酸在序列下方標示，保守的色氨酸位點用灰色突出顯示，DNA結合結構域，IRF相關結構域在序列上方標出.

圖2 中華鱉IRF4基因在組織/器官中相對表達量數(shù)據(jù)用平準值±標準差表示(n=3).下同.

圖3 脂多糖、聚肌胞苷酸誘導后外周血淋巴細胞中IRF4表達分析*示試驗組和對照組在相同采樣時間點差異顯著(P<0.05).下同.

3 討 論

3.1 表達分析

IRF4基因僅在免疫細胞中表達，可被不同絲裂原刺激物、抗原受體、脂多糖和白介素4等刺激誘導表達[16-17]。熒光定量結果顯示，中華鱉IRF4基因在所檢測組織及器官中表達，其中在血液、肝和脾中表達較高，這可能與血液、肝和脾中富含免疫細胞相關[18]。魚類IRF4基因主要在富含淋巴樣組織或黏膜組織中表達，如IRF4在黃鱔(Monopterusalbus)的腸、頭腎、體腎中表達量較高[19]，在褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)的脾、頭腎、鰓、腎中表達量較高[20]，在大黃魚(Pseudosciaenacrocea)的心臟和腎中表達較高[21]。在某些魚類如斑馬魚(Daniorerio)、鱖魚(Sinipercachuatsi)中，IRF4有2個同源基因即IRF4a和IRF4b，分別參與早期、晚期抗病毒反應[10,12]。此外，羅凱等[22]在草魚(Ctenopharyngodonidella)中發(fā)現(xiàn)，除IRF4a

圖4 過表達IRF4降低中華鱉肌肉來源細胞對中華鱉虹彩病毒敏感性a.過表達IRF4降低中華鱉肌肉來源細胞對中華鱉虹彩病毒敏感性；b.蛋白質印跡法檢測IRF4-flag融合蛋白在中華鱉肌肉來源細胞中表達.

圖5 過表達IRF4對干擾素、NF-κB啟動子活性影響鯉魚表皮瘤細胞分別共轉染干擾素啟動子(a)和NF-κB啟動子(b)，pRLTK，p3xflagcmv14或p3xflagIRF4, 48 h后收集細胞，檢測其熒光素酶活性； c.蛋白質印跡法檢測IRF4-flag融合蛋白在鯉魚表皮瘤細胞中表達.

和IRF4b基因外，還存在另一個成員IRF4-like基因，其中IRF4a和IRF4b基因在鰓中表達較高，IRF4-like基因在脾臟中表達最高；通過草魚呼腸孤病毒(Grasscarpreovirus，GCRV)攻毒發(fā)現(xiàn)IRF4a、IRF4b和IRF4-like基因均在病毒感染前期和前中期發(fā)揮作用。細菌模擬物脂多糖和病毒模擬物聚肌胞苷酸均能誘導中華鱉外周血淋巴細胞中IRF4基因表達，但是聚肌胞苷酸具有更強的誘導能力，揭示其可能主要在抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用。Xu等[19]發(fā)現(xiàn)無論是脂多糖、聚肌胞苷酸，或是嗜水氣單胞菌均能誘導黃鱔IRF4基因在脾、頭腎和鰓中表達。Liu等[20]發(fā)現(xiàn)，聚肌胞苷酸和淋巴囊腫病毒(Lymphocystisdiseasevirus，LCDV)誘導后，褐牙鲆IRF4b基因在淋巴樣組織中顯著表達，揭示其在抗DNA和RNA病毒免疫中發(fā)揮重要作用。

3.2 IRF4基因與抗病毒

和其他干擾素調節(jié)因子一樣，IRF4含有DNA結合結構域和IRF相關結構域[23]。其中DNA結合結構域主要負責與干擾素或者干擾素誘導基因的啟動子中的干擾素激活反應元件序列結合[24-26]，IRF相關結構域主要促進干擾素調節(jié)因子家族成員之間形成同源或異源二聚體，調節(jié)蛋白之間的作用。IRF4本身與DNA親和力弱，當與其他轉錄因子如PU.1或SPIB形成復合物后，其結合效率顯著增強，活化基因表達。然而，這種激活作用可被IRF8競爭性抑制[27]。EPC中過表達后，IRF4具有顯著誘導干擾素啟動子活性的作用，揭示其可能通過調節(jié)Ⅰ型干擾素的表達發(fā)揮抗病毒功能。中華鱉虹彩病毒是中華鱉重要的病毒性病原之一，嚴重制約著中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[28-30]。在體外抗病毒研究中，中華鱉STA細胞過表達IRF4基因能顯著抑制中華鱉虹彩病毒的增殖，其半數(shù)致死劑量為對照組的4.8倍(圖4)?？梢?，中華鱉IRF4基因參與抗病毒過程。另外，IRF4對干擾素啟動子及NF-κB啟動子的活性可被IRF8抑制(結果未顯示)，筆者將進一步研究IRF4和IRF8對基因的調控機理。

3.3 IRF4與NF-κB

NF-κB是一類廣泛存在于無脊椎、脊椎動物中的重要轉錄調節(jié)因子，可通過調控不同靶基因的表達在炎癥、免疫、應激、細胞增殖或凋亡等過程中起重要作用，NF-κB家族包括RelA(p65)、c-Rel、RelB、NF-κB1和NF-κB2，各成員之間以同源或異源二聚體形式行使其功能[31]。

IRF4基因的轉錄激活主要受轉錄因子STAT6、c-Rel調控。轉錄因子STAT6主要通過與IRF4啟動子中的TT(N)4-6AA特異序列結合來調控IRF4基因的轉錄激活；轉錄因子c-Rel隸屬NF-κB家族，通過與IRF4啟動子中的GGGA(N)1-2TTCC特異序列相結合來調控IRF4基因的轉錄激活[16-17]。IRF4對其表達還有自身調節(jié)作用，Li等[32]發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚中，過表達STAT1和c-Rel能顯著誘導IRF4啟動子活性，且IRF4a通過直接與STAT1、c-Rel結合負反饋調控其表達。本試驗結果表明，過表達IRF4后，其能抑制NF-κB啟動子活性，推測其可能是通過抑制NF-κB信號通路防止機體產(chǎn)生過度免疫應答而保護機體的。

本研究克隆了中華鱉IRF4基因，對其表達規(guī)律、免疫功能進行了初步研究，為進一步了解爬行動物IRF的網(wǎng)絡調節(jié)功能提供理論基礎。