楊翠華，王文章，陳華增，齊繼光

(青島海洋科技館，山東 青島 266003 )

咖啡金黃水母(Chrysaoramelanaster)又稱咖啡海刺水母，屬刺胞動物門、缽水母綱、旗口水母目、游水母科、金黃水母屬。主要生活在日本的白令海，在我國未見報道。雖然該水母中膠層薄，食用價值低，但其外形優(yōu)美，游姿優(yōu)雅，具極高的觀賞性，近年來許多水族館對其進行人工飼養(yǎng)、繁殖和展示[1-2]。

根據(jù)筆者多年飼養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，目前在高密度人工養(yǎng)殖條件下，多種水母出現(xiàn)了身體褪色和狀態(tài)下降等問題，嚴重降低了觀賞價值，增加了繁育成本。楊翠華等[3]認為，巴布亞硝水母(Mastigiaspapua)的外觀顏色是體內膠藍蛋白、蟲黃藻(Zooxanthella)和環(huán)境光線之間相互作用的結果。在人工養(yǎng)殖條件下，這種平衡會被破壞，導致水母顏色發(fā)生改變。因此，目前迫切需要對水母的著色與變色機理進行探討，找到養(yǎng)殖條件下水母變色的原因，并加以解決，從而使養(yǎng)殖品種體色更接近天然品種，提高觀賞價值。

魚類的體色主要是由一類稱之為類胡蘿卜素的色素決定，黑色素、嘌呤和虹彩細胞等也參與體色形成，同時體色也與魚的生理狀態(tài)和環(huán)境因素等有關[4-5]。但是，水母的體色細胞及相關的顯色機理研究尚未見報道。筆者參照魚體色的相關資料，結合多年的水母飼養(yǎng)經驗和咖啡金黃水母自身的特點，開展本次研究，觀察色素添加劑對水母體色的影響，并探討體內酪氨酸酶活力、總類胡蘿卜素含量等指標與外觀體色的相關程度，以期解決人工飼養(yǎng)水母色澤變暗的問題，對水母增色機理得出初步結論，得到觀賞性強的水母個體，為探究水母色素細胞的發(fā)育機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

試驗用咖啡金黃水母為青島海洋科技館繁育60 d的水母成體。水母飼養(yǎng)在0.6 m3水體的循環(huán)缸內，試驗用水經過黑暗沉淀、砂濾、臭氧、活性炭預處理，水溫18～20 ℃，鹽度32～33，pH 7.5～8.2，每周測定1次水質，保證NO2-≤0.01 mL/L，NH4+≤0.1 mL/L，每日于10:00、14:00投喂，基礎餌料為鹵蟲(Artemia)無節(jié)幼體、水母顆粒餌料和海月水母(Aureliaaurita)汁體積1∶1∶1的混合物。

1.1.2 試驗試劑及其使用方法

1.1.2.1 人工食用色素

胭脂紅、檸檬黃、亮藍和果綠4種色素由廣東省東莞市御豪食品有限公司(生產許可證編號: QS441901040493)生產。用飼喂吸管將人工食用色素滴在水母口腕部，2 mL/只。

1.1.2.2 水溶性熒光色素

人工水溶性熒光色素熒光紅、熒光黃、熒光藍、熒光綠由南京聚恩科技有限公司生產。試驗時，用注射器將4種色素分別注入水母胃囊，2 mL/只。

1.1.2.3 蝦青素

美國CareNet公司生產的美國時刻原裝進口天然蝦青素(雨生紅球藻中提取)，即3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素。試驗時，6 mg蝦青素粉末與20 g基礎餌料混勻，含量為300 mg/kg，用吸管投喂在水母的口腕部。

1.1.2.4 FeSO4

攀枝花市韋東工貿有限公司生產的分析純級FeSO4·7H2O。19.86 mg FeSO4·7H2O與20 g基礎餌料混勻，F(xiàn)e2+含量為200 mg/kg，用吸管投喂在水母的口腕部。

1.1.2.5 海蜇

每次稱取90 g青島海洋科技館繁殖飼養(yǎng)的90日齡海蜇(Rhopilemaesculentum)(圖1)，切成2～3 cm3碎塊，均勻放在水母口腕部，自主采食。

圖1 人工飼養(yǎng)90 d的海蜇

1.2 試驗方法

隨機將360只60日齡的試驗水母分為對照組、食用色素組(4種色素)、水溶性熒光色素組(4種色素)、蝦青素組、FeSO4組和海蜇組，觀察不同處理后的水母外觀體色、酪氨酸酶活力和總類胡蘿卜素含量的變化。水溶性熒光色素組僅在試驗第1 d注射1次熒光色素，正常飼喂基礎餌料1個月，其余處理組日投喂2次，連續(xù)1個月。

1.3 試驗指標測定方法

1.3.1 酪氨酸酶活力

取水母傘部或者口腕部3 g，加入1 mL pH 6.0的PBS緩沖液，冰凍勻漿，勻漿液在冰凍離心機上8000 r/min離心5 min，取上清液作為粗酶液(總溶液大于2 mL)。

取1 mg/mL L-酪氨酸0.5 mL，加入28 ℃預熱的2 mL酪氨酸酶粗酶液，總反應體積為2.5 mL，混合后立即室溫下于UV5100紫外分光光度計490 nm處測定吸光度(OD0)，10 min后再測吸光度值(OD10)。按下式計算酶活力值：

ΔOD490=OD10-OD0

式中，V為樣品體積，t為時間。

1.3.2 總類胡蘿卜素含量的測定

準確稱取3 g鮮樣品于25 mL棕色容量瓶中。加入7.5 mL浸提液(無水乙醇∶丙酮=5∶5)，蓋上塞子并旋轉振搖1 min。用移液管加入1 mL 40%KOH甲醇—水溶液(稱取200 g KOH溶解于50 mL水，用甲醇定容至500 mL)于容量瓶中，旋轉振搖1 min，將容量瓶于55.5 ℃水浴上加熱20 min，在容量瓶頸接上空氣冷凝裝置以防止溶劑損失。冷卻樣品，于暗處放置1 h。加入7.5 mL正己烷，旋轉振搖1 min，以10%硫酸鈉溶液定容，猛烈振搖1 min。于暗處靜置1 h后，將上層液放入1 cm比色皿中，以正己烷、丙酮混合液為空白對照(加蓋防止丙酮揮發(fā))，在UV5100紫外分光光度計下300～800 nm波長范圍內進行掃描，找出最大吸收峰所處的波長，在該波長下測定各組提取液的吸光值。測定標準質量濃度類胡蘿卜素，獲得本試驗的摩爾消光系數(shù)。

總類胡蘿卜素含量/mg·kg-1=(A×K×V)/(E×G)

式中，A為吸光度，K為稀釋倍數(shù)，V為提取液體積，E為摩爾消光系數(shù)，G為樣品質量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，計算測定指標的平均值±標準差，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗。使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，Duncan法進行多重比較，顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 水母體色變化

水母口腕部接觸人工食用色素后，在3～10 min色素到達胃囊腔，并沿輻管快速擴散。果綠色、胭脂紅色和檸檬黃色染色水母體色晶瑩透亮，亮藍色顏色略暗，但是4種色素均大大提升水母的觀賞性(圖2)。15～20 min后，水母通過傘部的輻管和觸手將色素開始排入水中，排出色素的過程持續(xù)2～3 h。口腕部主要是吸收色素，傘部輻管只能排出色素，僅有很少色素通過口腕部和觸手排出。色素的吸收和排出時間與色素種類無關，僅與接觸色素的部位相關。3 h后，每組水母均恢復原來的體色，4種色素間無差異，水母狀態(tài)未發(fā)現(xiàn)改變。30 d后水母全部存活，體色和狀態(tài)與未飼喂色素的水母(對照組)(圖2a)無明顯差異。

圖2 飼喂人工食用色素后咖啡金黃水母體色變化a.繁育60 d未飼喂色素的水母，b.飼喂果綠色素的水母，c.飼喂亮藍色素的水母，d.飼喂胭脂紅色素的水母，e.飼喂檸檬黃色素的水母.

水母口腕部接觸水溶性熒光色素后，不能將色素吸收到胃囊腔，但可以用2 mL注射器通過水母十字型口將熒光色素直接注入。熒光色素注入胃囊腔后，積聚在一起，10 h后才能通過水循環(huán)擴散到全身。注入熒光色素第1 d的效果見圖3。熒光染料對水母染色效果明顯，在第10 d時仍能很好地保持色素顏色，并且不影響流水母采食和存活，其狀態(tài)未發(fā)現(xiàn)明顯改變。至第15 d，水母體色逐漸變淺，但仍能觀察到熒光色素的顏色，并且未對水母狀態(tài)產生影響(圖4)。30 d試驗結束時，水母體仍能觀察到少許顏色，水母體態(tài)和大小與對照組無明顯差異。

圖3 飼喂水溶性熒光色素第1 d咖啡金黃水母體色變化a.熒光綠，b.熒光藍，c.熒光紅，d.熒光黃.

圖4 飼喂水溶性熒光色素第15 d咖啡金黃水母體色變化a.熒光綠，b.熒光藍，c.熒光紅，d.熒光黃.

咖啡金黃水母添加天然蝦青素、FeSO4和含有色素的海蜇30 d后，海蜇組的水母(圖5)比對照組顏色要深，而蝦青素組(圖6)、FeSO4組(圖7)的水母與對照組差異不明顯。結果表明，人工添加色素能獲得顏色各異的水母，水溶性熒光色素能長期保存在動物體內，可以作為染色色素，長期飼喂海蜇能夠維持自然狀態(tài)的體色，而添加蝦青素和FeSO4不能改善人工繁育水母的體色。

圖5 飼喂海蜇30 d的水母

圖6 添加蝦青素30 d的水母

圖7 添加FeSO430 d的水母

2.2 各處理組水母體內酪氨酸酶活力和總胡蘿卜素含量

試驗結果顯示，各組水母酪氨酸酶活力均較低，最高為海蜇組的0.133 U/mL(表1)，可能與咖啡金黃水母色素僅分布于外傘表面、色素含量較少有關。食用色素組和熒光色素組水母雖然體色鮮亮，但是因為色素并未在表皮和中膠層形成色素沉淀，因此本結果中兩項指標均與對照組差異不顯著(P>0.05)。添加蝦青素未顯著改變水母的體色，在本試驗中，蝦青素組酪氨酸酶活力最低，僅為0.109 U/mL。各組內個體間酪氨酸酶活力差異較大，F(xiàn)eSO4組和海蜇組的標準偏差大于測量平均值，并且6個樣本出現(xiàn)負值。各組間差異不顯著(P>0.05)。

經過分光光度計波長掃描，咖啡金黃水母中總胡蘿卜素在450 nm處吸光值最高。本方法中，海蜇組總胡蘿卜素含量最高，為251.01 mg/kg，與對照組差異顯著(P<0.05)。食用色素組總胡蘿卜素含量最低，酪氨酸酶活力僅高于蝦青素組，但與對照組差異均不顯著(P>0.05)。熒光色素組、蝦青素組、FeSO4組和對照組差異均不顯著(P>0.05)。

表1 4組水母酪氨酸酶活力和總胡蘿卜素含量

3 討 論

3.1 人工食用色素對水母體色的影響

本試驗中所用的4種色素均為人工合成的化學色素。胭脂紅、檸檬黃為偶氮類水溶性色素，亮藍是非偶氮色素，而果綠是檸檬黃和亮藍的混合物。胭脂紅給予大鼠口服時，大部分3～6 h后在盲腸和肝臟內被還原成1-氨基萘-4-磺酸和1-氨基-2-萘酚-6,8-二磺酸(NA)，被吸收的色素經膽道排泄[6]。兔經口攝入檸檬黃，48 h后分析尿液，得到原形色素(1%)、對氨基苯磺酸(74%)和對乙酞氨基苯磺酸(22%)，而對氨基苯磺酸正是合成檸檬黃的原料[7]。這表明胭脂紅和檸檬黃在大鼠及兔體內均很快被分解排出，難以在體內積累。由于亮藍色素易揮發(fā)并且穩(wěn)定性差，在自然光照條件下，極易被氧化分解，很難被機體消化吸收[8]。將該4種食用色素以2‰的比例加入基礎飼料中投喂金魚110 d，對體色無顯著影響[9]。

本試驗表明，4種人工食用色素可在短期內明顯改變試驗水母體色，但會隨水循環(huán)快速代謝到外界，長期投喂也不能被水母吸收或吸收量甚微。正如色澤鮮艷的魚飼料僅能短期增加魚的觀賞性一樣[9]，雖然市面上有各種顏色的水母餌料，但本試驗證明，通過添加人工食用色素改變水母體色的方法是難以達到持續(xù)維持的?？Х冉瘘S水母分為傘部和口腕部，本試驗色素的流動證明，口腕部和傘部的觸手不僅是采食器官，同時也具有排泄功能，消化后的食物轉化為液體或者細小顆粒，除主要通過傘部的輻管排出體外，少部分也能通過口腕部和傘部的觸手排泄。

3.2 水溶性熒光色素對水母體色的影響

熒光色素可分為堿性、酸性和中性熒光色素。本試驗用到的為中性的人工合成熒光色素，主要用于彩繪涂鴉、手工創(chuàng)意禮品、夜間警示、印染等領域，為生物不可分解物質。本試驗中熒光色素可以長期保存在水母胃囊內，對水母體的染色時間較長。注射后，熒光色素中水溶性部分攜帶部分小分子色素快速擴散，油溶性部分逐漸形成大顆粒，1 d后隨食物擴散到整個胃囊腔、輻管、觸手和口腕部，染色效果明顯，可保持30 d以上。并且因為色素在水母體內以大顆粒狀態(tài)存在，因此對水母采食、游動等無影響。本方法簡單易操作，在實踐中可提高水母的觀賞性，可用于水母染色。

3.3 蝦青素對水母體色的影響

蝦青素進入動物體后，可以不經修飾或生物轉化而直接貯存、沉淀在組織中，并可與肌動蛋白非特異性結合。汪洪濤等[10]認為，蝦青素在金魚體內以酯化形式沉淀，不同添加量和飼養(yǎng)時間對金魚的色素沉積有著極為顯著的影響。Booth等[11]研究表明，在澳大利亞金赤鯛(Pagrusauratus)餌料中添加蝦青素，72 mg/kg蝦青素組較36 mg/kg蝦青素組更易增加體色，但是兩者在飼喂6周和9周后皮膚顏色達到一致。本試驗中，添加蝦青素組水母狀態(tài)、游動能力和生長速度較其他組強，與野生水母接近，說明蝦青素能促進水母的生長，增強水母的體質。但蝦青素組的酪氨酸酶活力和總胡蘿卜素含量均較低，說明與其他水產動物和家禽類不同[12]，水母體內不含有肌動蛋白，因此短期添加蝦青素并不能改善水母體色。

3.4 FeSO4和海蜇對水母體色的影響

鐵是動物機體最必需的微量元素之一，它的主要功能是構成血紅蛋白，參與氧氣的運輸，是肌紅蛋白及細胞色素酶、過氧化物酶等的必需組成成分。影響日糧中鐵吸收的主要因素是有機和無機鐵的比例。動物源性飼料，如魚粉和肉粉中鐵的含量比較高，約為400～800 mg/kg，油類作物中含鐵100～200 mg/kg，谷物中含鐵30～60 mg/kg[13]。劉希光等[14]測定了新鮮海蜇皮、海蜇頭、生殖腺的含水量分別為95.89%、96.39%和96.09%，并利用JY38S型順序掃描電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定了上述部位新鮮海蜇樣品中鐵的含量分別為0.06、0.07、0.83 μg/L。

養(yǎng)殖條件下，許多水產動物體色會發(fā)生變化，如黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[15]、胡子鲇(Clariasfuscus)[16]等。本試驗在不添加外源色素的條件下，通過添加FeSO4，觀察微量元素鐵的補充對水母體表色素的影響。結果表明，添加外源性鐵對水母體色影響較小。飼喂海蜇能使水母體色加深，可能與海蜇含有色素有關，也可能是由于海蜇通過影響水母酶代謝等途徑促進了水母鐵的吸收和色素的沉積。

3.5 酪氨酸酶活力對水母體色的影響

動物體色與黑色素沉淀密切相關，酪氨酸酶在黑色素生成過程中起關鍵作用。在魚體內，酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴，再經過一系列的生化反應，最終生成黑色素。目前研究表明，黑色素不能正常形成主要有以下幾種原因[13]：

一是黑素細胞形態(tài)正常，但細胞中黑色素體的分布發(fā)生變化，這是動物短時間處于淺色背景、或光線較強等條件下發(fā)生的應激反應。當這些條件解除后，動物體色也恢復正常。在多年飼養(yǎng)過程中，筆者發(fā)現(xiàn)，水母體色與溫度、光照、背景等外部環(huán)境相關[3]，但這是一個長期過程，水母很少出現(xiàn)體色的驟然變化。

二是黑素細胞的生長狀態(tài)發(fā)生劇烈變化，細胞出現(xiàn)衰老、死亡，表現(xiàn)在黑素細胞樹突狀分支逐漸消失或減少、細胞萎縮，逐漸凋亡，這種變化通常使動物體色發(fā)生不可逆轉的變化?？Х冉瘘S水母在不同生長階段顏色表現(xiàn)不同，剛剛分裂的碟狀體呈紅色，水母幼體為無色透明狀，而水母成體外傘具18～24條咖啡色條紋，同時觸手和口腕部呈咖啡色[1]，日齡越大，水母顏色越深，說明生長過程中有黑色素生成和積累。

三是黑素細胞的分化、增殖受到影響，生物合成發(fā)生障礙，使成熟的黑素細胞數(shù)量顯著減少。本試驗中，添加海蜇組水母體色眼觀有明顯加深，而蝦青素雖然能增強水母的狀態(tài)，使水母生長速度加快，但是外觀顏色未發(fā)生改變。FeSO4組各項指標均較對照組無顯著差異。各組水母酪氨酸酶活力較低且差異不顯著，對照組僅為(0.126±0.093) U/mL，而黃顙魚血清中酪氨酸酶活力為(2.16±0.528) U/mL[15]，可能與水母色素僅僅分布于外傘表面，并且合成數(shù)量較少有關。

3.6 類胡蘿卜素對水母體色的影響

機體顏色濃淡的變化，是由于細胞內色素的集中、分散以及色素細胞數(shù)量的多少決定的。觀賞魚的豐富色彩可以通過含類胡蘿卜素的食物鏈而獲得。向梟等[17]報道，在紅劍尾魚(Xiphophorushelleri)和花瑪麗魚(Molliensiavelifera)養(yǎng)殖中添加50 mg/kg的類胡蘿卜素能有效地改善魚的體色，提高其觀賞價值。用添加100 mg/kg蝦青素的餌料投喂虹鱒(Oncorhynchusmykiss)4周，血清總類胡蘿卜素含量(1.83 μg/mL)極顯著高于對照組(0.25 μg/mL)[18]。

本試驗咖啡金黃水母中的類胡蘿卜素在450 nm處有最大吸收值，與向梟等[17]測定的魚類類胡蘿卜素在450 nm處有最大吸收值相同，說明兩者含有的類胡蘿卜素種類類似。本試驗中，海蜇組咖啡金黃水母體色最深，測定的酪氨酸酶活力和類胡蘿卜素含量也最高，說明水母的色素合成、沉淀可能與這兩項指標有關。

在日常飼養(yǎng)過程中，決定水母質量和狀態(tài)的不僅僅是體色，實踐證明，微量元素的合理補充對高質量的飼養(yǎng)仍是必須的，對水母體內類胡蘿卜素的積累也是有利的。