張曉雨，李 霞,2，秦艷杰，單莉娟，周詩嘉，王茂林，梁 艷，王縉云

(1.大連海洋大學，遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧 大連116023； 2.大連海洋大學，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

松江鱸(Trachidermusfasciatus)又名四鰓鱸，屬鲉形目、杜父魚科、松江鱸屬，為降海洄游性魚類，是我國渤海、黃海、東海沿岸及相鄰淡水水域的習見魚類。松江鱸肉質(zhì)鮮美細嫩且體態(tài)多變，被譽為“中國四大名魚”之一[12]。同時，松江鱸由于近年來數(shù)量的減少，已被列為國家二級重點保護野生動物。關于松江鱸的生物學研究較少，邵炳緒[13]研究了松江鱸的生長習性；韋正道等[14]報道了影響松江鱸生長的環(huán)境因子。近幾年關于松江鱸的人工育苗和養(yǎng)殖研究的報道較多[15-18]。在細胞方面，目前已報道的相關研究有松江鱸脾[19]和鰭[20]細胞系的短期體外培養(yǎng)以及重金屬對松江鱸腎細胞系的毒性研究[10]等。筆者對可連續(xù)傳代的松江鱸腎組織細胞系進行生長狀況描述和細胞遺傳學分析，并測定其對病毒、重金屬鎘的敏感性，旨在探明松江鱸腎細胞系的特性，為該細胞系在松江鱸病毒性疾病的研究及其作為重金屬鎘污染的生物學標志物研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用松江鱸腎組織細胞系由大連海洋大學細胞工程實驗室提供。鯉春病毒血癥病毒(Springviraemiaofcarpvirus)和魚類諾達病毒(Piscinenodavirus)由大連海洋大學病害實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)于25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，所用的培養(yǎng)基為20% FBS-DMEM/F12，采用文獻[18]中胰蛋白消化法傳代。

1.2.2 細胞凍存與復蘇

參照文獻[21]稍作改動，按照1∶1∶3比例，將二甲基亞砜(DMSO)、FBS和DMEM/F12配制成凍存液，并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。選取75代生長狀態(tài)良好，并處于對數(shù)生長期的松江鱸腎細胞，用0.25%的胰酶消化后，加入培養(yǎng)基重懸細胞并收集在無菌離心管中。將細胞懸液以轉(zhuǎn)速1500 r/min離心5 min。棄上清液，向離心管中加入1 mL凍存液，重懸細胞，調(diào)整細胞密度至1.0×106個/mL后，轉(zhuǎn)移到無菌凍存管中。將裝有細胞的凍存管按照順序進行梯度降溫，操作步驟為：4 ℃冰箱中放置30 min，-20 ℃冰箱中4 h，-80 ℃冰箱中24 h，之后轉(zhuǎn)移到液氮(-196 ℃)中，長期保存。

從液氮中取出已凍存30 d的細胞，迅速放在40 ℃的溫水中水浴解凍，待凍存液90%融化后，轉(zhuǎn)移至25 ℃的溫水中水浴1 min。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，向離心管中加入1 mL 20% FBS-DMEM/F12的培養(yǎng)基，1500 r/min，離心5 min，棄上清液。在離心管中加入2 mL 20% FBS-DMEM/F12的培養(yǎng)基重懸細胞。充分混勻后，吸取100 μL細胞懸液到青霉素小瓶中，向其中加入100 μL的臺盼藍，在光學顯微鏡下，用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，計算凍存細胞存活率。

細胞存活率/%=(n2/n1)×100%

式中，n1為細胞總數(shù)(個)，n2為活細胞數(shù)(個)。

1.2.3 生長曲線的測定

取生長狀態(tài)良好的75代松江鱸腎細胞，用0.25%的胰酶消化，加入2 mL 20% FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基吹打細胞，制成細胞懸液，調(diào)整細胞懸液密度至5×104～8×104個/mL。將細胞懸液接種至24孔板中，每孔接種500 μL，共接種21孔。將24孔板放于25 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h取3孔細胞進行細胞計數(shù)，并計算其密度，連續(xù)計數(shù)7 d。以培養(yǎng)時間(d)為橫坐標，以細胞密度(個/mL)為縱坐標，繪制細胞生長曲線。根據(jù)公式計算細胞的群體倍增時間：

T=t×lg2/lg(nt/n0)

式中，T為群體倍增時間(d)，nt為時間t(d)后的細胞數(shù)(個)，n0接種細胞數(shù)(個)。

1.2.4 細胞染色體分析

染色體制備方法參照文獻[22]并稍做改動。取35代生長狀態(tài)良好并處于對數(shù)生長期的松江鱸腎細胞，向培養(yǎng)基中加入秋水仙素，調(diào)整秋水仙素質(zhì)量濃度為1 μg/mL，放回25 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用0.25%的胰酶消化重懸細胞。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，1000 r/min，離心10 min，棄上清液。向離心管中加入低滲液，在25 ℃下低滲30 min，低滲液為0.075 mol/mL KCl溶液。30 min后1000 r/min離心5 min。用Carnoy固定液固定15 min，連續(xù)固定3次，之后放入4 ℃冰箱中過夜。染色體制片方法采用冷滴片法，并在室溫下自然干燥。用Giemsa染液染色30 min，用流水輕輕洗去浮色后室溫下自然干燥。在顯微鏡下找到完整的染色體分裂相，統(tǒng)計數(shù)目并拍照。

1.2.5 兩種病毒對松江鱸腎細胞的感染試驗

選取生長狀態(tài)良好的50代松江鱸腎細胞，吸去舊培養(yǎng)基，用無菌PBS輕輕沖洗細胞2次。將細胞分為3組，分別為2個試驗組和1個對照組，2個試驗組分別加入0.1 mL鯉春病毒血癥病毒液和0.1 mL魚類諾達病毒液，隨后各加入0.1 mL 20% FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基，每組設置3個平行。將3組細胞放入25 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，分別吸去病毒液和培養(yǎng)基，加入5 mL 20% FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基，再放回25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細胞形態(tài)并拍照記錄細胞病變效應，無論接毒細胞是否出現(xiàn)細胞病變效應，都繼續(xù)進行盲傳接毒，每隔5 d盲傳一次。

1.2.6 鯉春病毒血癥病毒在松江鱸腎細胞系上的滴度測定

選取生長狀態(tài)良好的50代松江鱸腎細胞，用0.25%胰酶消化重懸細胞，將細胞懸液密度調(diào)整至1.0×105個/mL。將細胞懸液接種至96孔板中，每孔接種200 μL，放回25 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸除舊培養(yǎng)基，更換為相同體積的病毒懸液，病毒懸液按照10倍系列稀釋，每稀釋度8孔。之后放回25 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察細胞形態(tài)并拍照記錄細胞病變效應出現(xiàn)情況。根據(jù)Reed-Muench公式計算病毒滴度值。

1.2.7 松江鱸腎細胞系對鎘離子敏感性研究

取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的60～70代松江鱸腎細胞，用0.25%胰酶消化重懸細胞，調(diào)整至細胞密度為1.0×105個/mL，接種在96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種200 μL懸液。將其放在25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)基，加入等體積的含有氯化鎘的培養(yǎng)基，鎘離子濃度分別為0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 μmol/L，每個濃度設置3個重復。放回25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，向每孔中加入40 μL MTT，放入CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)基，用PBS快速沖洗2次。在每個孔內(nèi)加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，室溫振蕩15 min。用酶標儀測其在570 nm波長下的吸光度值(A)。將氯化鎘濃度為0的一組設為陰性對照組，沒有細胞只加入相同體積新鮮培養(yǎng)液的一組設為陽性對照組。

細胞存活率/%=(A試驗組-A陽性對照組)/(A陰性對照組-A陽性對照組)×100%

2 結(jié) 果

2.1 細胞凍存與復蘇

松江鱸腎細胞凍存30 d后復蘇，細胞貼壁情況良好，36～48 h后，可以鋪滿瓶底。經(jīng)計算，存活率為(90.8±1.37)%。

2.2 生長曲線測定

由第75代松江鱸腎細胞生長曲線可見，在25 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，于20% FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)的松江鱸腎組織細胞在0～2 d處于潛伏期，2～4 d進入對數(shù)生長期，4～6 d進入穩(wěn)定期(圖1)，經(jīng)計算，松江鱸腎組織細胞的群體倍增時間為55.2 h。

2.3 染色體分析

通過對35代松江鱸腎組織細胞中100個圖像清晰、中期分裂相分散較好的松江鱸腎細胞的染色體進行統(tǒng)計計數(shù)，發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目分布為37～42，其中染色體眾數(shù)為40的細胞占全部計數(shù)細胞的70%。通過核型分析可知，核型公式為K(2n)=40=16m+10sm+14t，NF=76，即松江鱸腎細胞有8對中部著絲點染色體(m)，5對亞中部著絲點染色體(sm)，7對端部著絲點染色體(t)(圖2、圖3)。

圖1 第75代松江鱸腎細胞的生長曲線

圖2 松江鱸腎細胞的染色體數(shù)目分布

圖3 松江鱸腎細胞的中期分裂相

2.4 兩種病毒對松江鱸腎細胞的感染試驗

正常松江鱸腎細胞為長纖維型(圖4a)，被鯉春病毒血癥病毒感染3 d后的松江鱸腎細胞收縮變圓、折光度增加，聚集成團或解體死亡。感染4 d后的松江鱸腎細胞碎片增多，細胞脫落，產(chǎn)生典型細胞病變效應(圖4b)，經(jīng)測定病毒滴度為106.53/mL。在盲傳2代后發(fā)現(xiàn)松江鱸腎細胞對魚類諾達病毒不敏感，細胞未出現(xiàn)病變。

2.5 鎘離子對松江鱸腎細胞成活率的影響

用不同濃度的氯化鎘處理松江鱸腎細胞后，隨著鎘離子濃度的增加松江鱸腎細胞存活率逐漸降低，細胞存活率與鎘離子濃度有明顯的劑量依賴關系(圖5)。根據(jù)存活率與濃度的自然對數(shù)劑量—效應方程y=-0.00448x+1.1025(r2=0.95832)，可得半致死濃度為(130±9.1) μmol/L。當鎘離子濃度達到200 μmol/L時，細胞難以存活。

圖4 正常松江鱸腎細胞(a)和接種病毒后的典型細胞病變效應(b)

圖5 鎘離子對松江鱸腎細胞成活率的影響

3 討 論

3.1 松江鱸腎細胞生長特性分析

曾有研究提出松江鱸腎細胞系的染色體數(shù)目與本試驗結(jié)果相同，均為2n=40，但是其染色體臂數(shù)為NF=64和NF=60[26]，與本試驗中的核型公式K(2n)=40=16m+10sm+14t中NF=76不同。分析可能為松江鱸所處的生活環(huán)境和取樣時間不同所致。

李樹深[27]指出，染色體端部著絲粒較多的種類為原始種類，中部和亞中部著絲粒較多的是特化種類，染色體臂數(shù)較少的類群同染色體臂數(shù)較多的類群相比，染色體臂數(shù)較多的類群特化。絨杜父魚(Hemitripterusvillosus)同松江鱸同屬于杜父魚科，其核型為2n=46=20m+16sm+10t，NF=82[28]。絨杜父魚的染色體臂數(shù)多于松江鱸，說明絨杜父魚相比松江鱸，為特化類群，松江鱸端部著絲粒多于絨杜父魚，中部和亞中部著絲粒少于絨杜父魚，由此可以說明，松江鱸相較絨杜父魚，為原始種類。

3.2 松江鱸腎細胞的病毒敏感性

一般情況下，動物病毒對物種及其細胞系的敏感性均有特異性。但是有研究表明，一種魚類細胞系對幾種病毒均具有敏感性，例如斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)腦組織細胞系(GB11)對神經(jīng)壞死病毒(Neuronecrosisvirus)和石斑魚虹彩病毒(Grouperiridovirus)敏感[29]。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，一種病毒能感染幾種細胞系，例如中華鱉病毒(Trionyxsinesisvirus)能使鯉魚上皮乳狀瘤細胞、鰻鱺性腺細胞和草魚卵巢細胞產(chǎn)生病變[30]；神經(jīng)壞死病毒感染斜帶石斑魚腦細胞[29]和花鱸(Lateolabraxmaculatus)腦細胞[31]后，均能使細胞產(chǎn)生病變。

鯉春病毒血癥病毒，又名鯉彈狀病毒，屬彈狀病毒科，水泡病毒屬(Vesiculorirus)。鯉春病毒血癥是由鯉春病毒血癥病毒引起鯉魚科的一種急性、出血性、傳染性疾病，死亡率極高，多發(fā)于鯉科魚類，是全球性魚類疾病[32]。研究表明，本試驗建立的松江鱸腎組織細胞系對鯉春病毒血癥病毒敏感，可用來分離和擴增該病毒。目前在松江鱸的人工養(yǎng)殖中尚未發(fā)現(xiàn)大規(guī)模病毒病的暴發(fā)，但腎組織細胞系的建立可為將來病毒病的研究打下基礎。

3.3 鎘離子對松江鱸腎細胞成活率的影響

鎘是我國水生生態(tài)系統(tǒng)中常見的重金屬污染物，具有高致毒性，較低劑量的鎘就能使水生動物中毒，甚至死亡[33]。本試驗用不同濃度的鎘離子處理松江鱸腎細胞24 h后，結(jié)果顯示，隨著鎘離子濃度的升高細胞存活率降低，半致死濃度為(130±9.1) μmol/L。近年來，關于鎘離子對魚類的毒性研究較多，鎘離子對大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)的半致死濃度為433.2 μmol/L[34],對鯽魚和泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)的半致死濃度分別為344 μmol/L和351 μmol/L[35]，說明相對于成體魚，細胞系對鎘離子更敏感，這可能與魚體本身具有自我調(diào)節(jié)能力有關，但也說明細胞系更適宜用來作為水質(zhì)監(jiān)測的指標和機理研究。