吳云輝,嚴麗娟,沈鷺英,林立毅,張 峰,徐敦明*

(1. 廈門海關檢驗檢疫技術中心, 福建 廈門 361026; 2. 廈門海洋職業(yè)技術學院, 福建 廈門 361100;3. 中國檢驗檢疫科學研究院, 北京 100176)

氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides, AGs)可以有效抑制細菌的生長和繁殖,在臨床上用于治療綠膿桿菌、革蘭氏陰性菌感染,在農(nóng)業(yè)上也被作為動物促生長劑添加到飼料中。AGs具有廣譜抗菌特性,但其具有明顯的副作用,比如神經(jīng)肌肉傳導阻滯,腸道功能損害以及耳毒性、腎毒性等,并且AGs會在生物組織中富集,殘留時間較長。如果消費者食用了AGs殘留超標的食品,可能會對身體健康造成危害。歐盟已經(jīng)明確禁止將AGs作為畜禽促生長添加劑使用,而近年來我國也對AGs在動物源食品中的殘留進行了嚴格控制。在我國,蜂農(nóng)常不科學地使用AGs防治蜜蜂幼蟲病,導致蜂產(chǎn)品中AGs殘留超標事件時有發(fā)生。因此,加強蜂產(chǎn)品中AGs殘留的監(jiān)控具有非常重要的現(xiàn)實意義。

AGs的主要結構包括氨基糖和堿性1,3-二氨基肌醇,二者通過苷鍵連接。由于1,3-二氨基肌醇具有堿性多元環(huán)己醇結構,AGs通常具有較強的堿性和極性,在普通反相色譜柱上沒有保留。傳統(tǒng)方法通常在流動相或者進樣溶液中加入離子對試劑,如七氟丁酸等,以改善液相色譜的分離效果[1-6]。但是,離子對試劑對質譜檢測器的影響較大,特別是離子抑制和離子源污染問題。除了離子對色譜法,親水液相色譜色譜法(HILIC)也得到了較為廣泛的應用,其原理是通過在流動相中加入緩沖鹽(如甲酸銨等)以增強AGs在色譜柱上的保留,從而與雜質進行較好的分離[7-14]。

目前,AGs的分離檢測仍然是獸藥殘留檢測領域的難點之一,混合保留模式可能是解決這一問題較理想的方法。混合型離子交換液相色譜柱,對于極性化合物的分離具有很好的效果,到目前為止已被成功應用于各類動物源性食品(水產(chǎn)品和肉制品等)中AGs殘留的分析[15-17]。

本文采用分子印跡固相萃取柱凈化,混合型離子交換液相色譜-串聯(lián)質譜法進行分離檢測,全程不添加離子對試劑,建立了同時測定蜂蜜中5種氨基糖苷類抗生素的方法。該方法具有選擇性好、靈敏度高、重復性好等優(yōu)點,且對質譜儀無污染,適用于蜂蜜中鏈霉素、雙氫鏈霉素、壯觀霉素、卡那霉素和阿米卡星等5種氨基糖苷類抗生素的檢測,對于控制抗生素在蜜蜂養(yǎng)殖業(yè)中的使用、保障蜂蜜質量安全具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司); QTRAP 6500三重四極桿-線性離子阱復合質譜儀,配有電噴霧電離(ESI)源(美國AB SCIEX公司);Allegra 64R型高速冷凍離心機(美國Beckman公司); 12通道半自動固相萃取裝置、SupelMIP Aminoglycosides分子印跡固相萃取柱(50 mg/3 mL(美國Supelco公司);旋渦混合器(德國IKA公司); Obelisc R色譜柱(100 mm×2.1 mm, 5 μm,美國SIELC公司)。

鏈霉素、雙氫鏈霉素、壯觀霉素、卡那霉素和阿米卡星等5種氨基糖苷類抗生素標準品均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司,純度均大于94%。甲酸、氨水、乙腈和甲醇均為色譜純;二氯甲烷、磷酸、磷酸氫二鉀均為分析純。實驗用水由Milli-Q系統(tǒng)(美國Millipore公司)制得。

50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)的配制:稱取8.7 g磷酸氫二鉀,加入950 mL水溶解,用磷酸調節(jié)pH值至8.0,用水定容至1 L。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取適量標準品,分別用水溶解并定容,配制成質量濃度為100 mg/L的標準儲備液,于4 ℃避光保存。吸取各標準儲備溶液,用水稀釋成質量濃度為1.0 mg/L的混合標準儲備液,于4 ℃避光保存。以空白基質溶液將混合標準儲備液稀釋至適當濃度,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

稱取2 g(精確至0.01 g)蜂蜜樣品,置于50 mL塑料離心管中,加入5 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)溶液,充分渦旋混合3 min后,以9 000 r/min離心5 min,收集上清液，待凈化。

1.3.2凈化

SupelMIP Aminoglycosides分子印跡固相萃取柱依次用3 mL甲醇和3 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)活化,然后將提取液全部過柱,控制上樣流速小于1 mL/min,棄去流出液。依次以3 mL水和1 mL 0.1%(v/v)氨水淋洗,真空抽干5 min,再用1 mL乙腈-水(40∶60, v/v)溶液淋洗,然后真空抽干10 s,再用1 mL二氯甲烷-甲醇(50∶50, v/v)溶液淋洗,然后真空抽干10 s,整個淋洗過程控制流速小于1 mL/min。最后用1.0 mL乙腈-水(20∶80, v/v)溶液(含5%(v/v)甲酸)洗脫至塑料管中,控制洗脫流速小于0.5 mL/min,收集洗脫液,經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾至2 mL塑料進樣瓶中,供混合型離子交換液相色譜-串聯(lián)質譜測定。

1.4 分析條件

1.4.1液相色譜條件

一些高職院校在開設旅游專業(yè)時，并沒有相應的師資力量作為基本保障，所以不少院校通過掛靠在不同院系下進行招生，這種情況很容易出現(xiàn)課程設置不合理的問題。課程設置不科學不合理就會導致學生難以形成一個完整的旅游專業(yè)知識體系，這在一定程度上脫離了高職教育的基本目的，不僅影響到旅游專業(yè)畢業(yè)生的就業(yè)，還嚴重制約了學生的進一步發(fā)展。

色譜柱:Obelisc R色譜柱(100 mm×2.1 mm, 5 μm);柱溫:35 ℃;流速:0.4 mL/min;流動相:(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液和(B)乙腈;梯度洗脫程序:0～2.0 min, 95%B; 2.0～5.0 min, 95%B～65%B; 5.0～8.0 min, 65%B～5%B; 8.0～14.0 min, 5%B; 14.0～14.1 min, 5%B～95%B; 14.1～20.0 min, 95%B。進樣量:10 μL。

1.4.2質譜條件

離子源:電噴霧電離源;掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應監(jiān)測(MRM)模式;電噴霧電壓(IS): 5 500 V;離子源溫度(TEM): 550 ℃;霧化氣壓力(GS1): 345 kPa;輔助氣壓力(GS2): 345 kPa;氣簾氣壓力(CUR): 241 kPa;碰撞氣壓力(CAD)模式:中度(medium);入口電壓(EP): 10 V;出口電壓(CXP): 10 V;滯留時間(dwell time): 20 ms。5種氨基糖苷類藥物的監(jiān)測離子對、聚焦電壓(DP)、碰撞能量(CE)見表1。

表 1 5種氨基糖苷類抗生素的質譜參數(shù)

* Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

氨基糖苷類抗生素具有堿性,且極性較大,普通的C18反相固相萃取小柱難以將其保留。本實驗選擇了具有分子印跡功能的SupelMIP Aminoglycosides固相萃取柱,該固相萃取柱是由高度交聯(lián)的聚合物組成,在聚合物合成中引入模板分子,可選擇性地吸附與模板分子結構類似的分析物,因此具有極高的選擇性,可有效降低基質干擾,從而獲得較低的檢出限。實驗結果發(fā)現(xiàn),采用分子印跡固相萃取柱萃取后,5種氨基糖苷類藥物的回收率均在85%以上,并且因為分子印跡固相萃取柱的選擇性較好,只有具有氨基糖苷類似結構的目標化合物才能被洗脫,因此對樣品凈化具有較好的效果。

采用SupelMIP Aminoglycosides固相萃取柱凈化時有推薦的活化、淋洗、洗脫方法,推薦的洗脫液為1 mL乙腈-水(20∶80, v/v)溶液(含5 mmol/L七氟丁酸和1%(v/v)甲酸)。實驗對該洗脫液進行了優(yōu)化,不添加離子對試劑七氟丁酸,同時改變甲酸的體積分數(shù),比較了洗脫液中含1%、2%、5%和10%(v/v)甲酸時目標化合物的回收率。實驗發(fā)現(xiàn)。當洗脫液中甲酸的體積分數(shù)為1%或2%時,只能洗脫部分氨基糖苷類藥物,回收率在40%以下;而當洗脫液中甲酸的體積分數(shù)≥5%時,5種氨基糖苷類藥物可被洗脫,回收率均大于85%。因此,本實驗選擇乙腈-水(20∶80, v/v)溶液(含5%(v/v)甲酸)作為洗脫溶液。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

在優(yōu)化條件下,5種氨基糖苷類抗生素基質匹配混合標準溶液(20 μg/L)的MRM色譜圖見圖1。

圖 1 5種氨基糖苷類抗生素基質匹配混合標準溶液(20μg/L)的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of the five aminoglycosides in a matrix matching mixed standard solution (20μg/L)

2.3 色譜條件的優(yōu)化

由于氨基糖苷類藥物的極性較強,采用普通的反相色譜柱沒有保留,通常需要在流動相中加入離子對試劑,化合物才能獲得較好的保留。在不添加離子對試劑的情況下,通常采用親水作用色譜柱進行分離,不同色譜柱因固定相種類不同,色譜保留機理存在一定差異[8,11]。Obelisc R色譜柱具有混合型離子交換色譜的機理,分析物與色譜柱固定相存在離子交換的作用機制,即在酸性條件下,堿性物質呈陽離子狀態(tài),在固定相上的吸附能力較強,保留較強。由于鏈霉素、雙氫鏈霉素、壯觀霉素、卡那霉素和阿米卡星等5種氨基糖苷類抗生素的pKa均大于7,為強堿性化合物,當緩沖液pH小于pKa時,化合物以離子形式存在。實驗分別采用體積分數(shù)為0.1%、0.5%和1%的甲酸水溶液和乙腈作為流動相,考察甲酸的體積分數(shù)對色譜分離的影響。實驗發(fā)現(xiàn),隨著甲酸體積分數(shù)的增大,5種抗生素的保留時間縮短,但是峰形變差,特別是壯觀霉素的色譜峰出現(xiàn)分叉,所有化合物的靈敏度均降低。因此最后選取0.1%(v/v)甲酸水溶液和乙腈作為流動相,5種氨基糖苷類抗生素在Obelisc R色譜柱上可獲得滿意的保留和峰形。

2.4 線性范圍和定量限

取空白蜂蜜基質溶液,加入系列已知量的氨基糖苷類藥物,配制鏈霉素和雙氫鏈霉素質量濃度分別為5、10、20、50和100 μg/L,壯觀霉素、卡那霉素和阿米卡星質量濃度分別為20、50、100、250和500 μg/L的系列基質匹配混合標準溶液,然后進行測定,以定量離子的響應峰面積(y)對相應的質量濃度(x, μg/L)進行線性回歸。

實驗結果表明,5種氨基糖苷類藥物在相應的線性范圍內定量離子的響應峰面積和樣品濃度間具有良好的線性關系,相關系數(shù)(r)均大于0.998(見表2)。

表 2 5種氨基糖苷類抗生素的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)和定量限

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

以不含待測組分的蜂蜜為空白基質樣品,采用空白樣品添加目標化合物的方法,按照1.3節(jié)和1.4節(jié)步驟處理,以特征離子色譜峰的信噪比(S/N)≥10為方法的定量限,計算5種氨基糖苷類抗生素的定量限。鏈霉素和雙氫鏈霉素的定量限為5 μg/kg,壯觀霉素、卡那霉素和阿米卡星的定量限為20 μg/kg。文獻[8]采用Merck ZIC-HILIC色譜柱對蜂蜜中氨基糖苷類藥物進行分析,其中這5種氨基糖苷類藥物的定量限為7～34 μg/kg。除壯觀霉素外,本實驗分析的其他4種化合物的定量限均優(yōu)于文獻方法。

2.5 回收率和精密度

分別向空白蜂蜜樣品中添加1倍、2倍和5倍定量限水平的混合標準溶液,每個添加水平取6個平行樣品,按1.3節(jié)和1.4節(jié)描述進行處理和測定,計算各個添加水平的回收率和精密度。

由表3可以看出,5種氨基糖苷類藥物的平均回收率為75.1%～92.3%,相對標準偏差為4.5%～10.7%,表明該方法具有較好的準確度和精密度,能夠滿足日常檢測的分析要求。

2.6 實際樣品分析

采用本方法對市售的15份蜂蜜樣品進行檢測,均未檢出鏈霉素、雙氫鏈霉素、壯觀霉素、卡那霉素和阿米卡星等5種氨基糖苷類抗生素。

表 3 蜂蜜樣品中5種氨基糖苷類抗生素的加標回收率和精密度(n=6)

3 結論

本文建立了混合型離子交換液相色譜-電噴霧電離三重四極桿-線性離子阱復合質譜測定蜂蜜中鏈霉素、雙氫鏈霉素、壯觀霉素、卡那霉素和阿米卡星等5種氨基糖苷類抗生素的檢測方法。本方法簡便快速,線性范圍寬,定量限低,重復性好,全程不添加離子對試劑,有效避免了對質譜儀的污染,各項技術指標均能滿足日常檢測的分析要求,可用于蜂蜜中5種氨基糖苷類抗生素的測定。