林 濤,魏茂瓊,余積東,李茂萱,鄒艷虹,沙凌杰,劉宏程*

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所, 云南 昆明 650205; 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(昆明), 云南 昆明 650205; 3. 云南省德宏州芒市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測站, 云南 芒市 678400)

云南因其特殊的地理位置和氣候條件而擁有豐富的野生食用菌資源,其營養(yǎng)豐富、味道鮮美,深受消費(fèi)者的喜愛。然而,在2008年11月,德國的EUROFINS實(shí)驗(yàn)室[1]報(bào)道了牛肝菌中尼古丁含量超標(biāo)(德國規(guī)定食用菌鮮品中的最大殘留限量為0.05 mg/kg),野生食用菌中的尼古丁受到了廣泛的關(guān)注。研究[2]結(jié)果表明,尼古丁屬內(nèi)源性代謝產(chǎn)物,不同產(chǎn)地品種的食用菌中都能檢出尼古丁,且同一子實(shí)體的不同部位中尼古丁的含量差別較大。為此,各國也紛紛為食用菌中的尼古丁規(guī)定了最大殘留限量。2009年,歐盟[3]修訂了食用菌類中尼古丁的最大殘留限量,即食用菌鮮品中為0.036 mg/kg,干燥牛肝菌為2.3 mg/kg,除牛肝菌外的干燥野生菌為1.17 mg/kg。日本肯定列表[4]中規(guī)定了草菇中的最大殘留限量為2 mg/kg。

尼古丁又名煙堿,對(duì)生物體具有很多毒副作用,能夠使心跳加快、血壓上升和精神狀況改變等,可促進(jìn)血小板凝集,造成心血管阻塞、中風(fēng)等急慢性疾病[5-8]。野生食用菌的種類較多,基質(zhì)成分復(fù)雜,尼古丁在不同野生食用菌中的含量各不相同,常規(guī)測定方法難以達(dá)到測定要求,因此,目前對(duì)于野生食用菌中尼古丁測定方法的文獻(xiàn)報(bào)道不多。Cavalieri等[9]利用QuEChERS方法對(duì)不同食用菌中尼古丁進(jìn)行了測定,但其未考慮到野生菌干樣在提取前的復(fù)水性因素,影響了最終的尼古丁提取效率;Lin等[10]利用毛細(xì)管電泳-安培檢測器測定了食用菌中的尼古丁含量,其靈敏度無法滿足部分低含量尼古丁的食用菌的測定;Müller等[11]利用GC-MS/MS測定了食用菌中尼古丁的含量,該方法操作相對(duì)簡單,但是也存在一定的基質(zhì)干擾;Wang等[12]利用高通量動(dòng)態(tài)微波輔助萃取,并結(jié)合在線SPE測定了食用菌中的尼古丁含量,得到了較好的分析效果,但是該方法采用的技術(shù)較先進(jìn),不利于實(shí)驗(yàn)室的廣泛使用;楊俊等[13]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定了食用菌中的尼古丁,但是該方法采用了純水作為提取溶劑,提取溶液成分復(fù)雜,不利于后續(xù)的質(zhì)譜定量分析。

目前,在野生食用菌中尼古丁測定過程中普遍存在基質(zhì)復(fù)雜、提取效率低、凈化效果差及靈敏度低等現(xiàn)象,針對(duì)這些問題,本研究對(duì)傳統(tǒng)的QuEchERS方法、尼古丁的色譜和質(zhì)譜條件等進(jìn)行優(yōu)化,以期建立測定野生食用菌中尼古丁的高效、快速、高靈敏的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

API 5500 Q TRAP三重四極桿質(zhì)譜儀(美國AB公司); 1290Ⅱ超高效液相色譜儀(美國Agilent公司); ZORBAX RRHD色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美國Agilent公司); BSA224S-CW電子分析天平(德國Sartorius公司);渦旋混勻器(美國Thermo Scientific公司); TDL-40C高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

尼古丁(純度為99%)購買于加拿大Toronto Research Chemicals公司;甲醇和乙腈(均為色譜純)購買于德國Merck公司;無水硫酸鎂、NaCl、乙酸銨、氨水(均為分析純)購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲酸(色譜純)、石墨化碳黑(GCB)吸附劑(45 μm)購買于美國Sigma公司; ProElut NH2、C18、N-丙基乙二胺(PSA)、Florisil填料(50 μm)均購買于中國迪馬科技;純凈水(購買于杭州娃哈哈公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取10 mg尼古丁,用乙腈溶解后定容至10 mL,得到1 g/L的尼古丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,再用乙腈稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,于-20 ℃下避光保存。

1.2.2樣品處理

野生食用菌子實(shí)體,包括其菌蓋和菌柄經(jīng)烘干后粉碎混勻(新鮮樣品將其整個(gè)子實(shí)體勻漿混勻),參照文獻(xiàn)[14-17]的方法加以改進(jìn),稱取0.5 g野生食用菌干樣(鮮樣稱取5.0 g)于離心管中,加入2 mL水(鮮樣無需加水),渦旋1 min后靜置15 min,使樣品充分潤濕,再加入10 mL氨水-乙腈(6∶94, v/v)提取液,渦旋振蕩2 min后加入3 g NaCl,渦旋混勻后以5 000 r/min的速度離心5 min,取2 mL上清液于另一離心管中,加入200 mg無水硫酸鎂、150 mg PSA和50 mg GCB,渦旋混合1 min后,以5 000 r/min的速度離心2 min,吸取1.0 mL上層提取液,過0.22 μm有機(jī)相濾膜,待分析。

1.2.3色譜條件

利用乙腈和0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)氨水溶液作為流動(dòng)相。流速:0.2 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:0.5 μL,梯度洗脫步驟如表1所示。

表 1 梯度洗脫參數(shù)

1.2.4質(zhì)譜條件

采用ESI源,正離子MRM掃描模式,參照文獻(xiàn)[18-21]中相關(guān)質(zhì)譜條件,并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)儀器條件進(jìn)行優(yōu)化,得到相關(guān)參數(shù)如下:氣簾氣流速為20 L/h,霧化氣流速為55 L/h,輔助氣流速為55 L/h,輔助加熱氣溫度為650 ℃,噴霧電壓為5 500 V。定量離子對(duì)為m/z163.0>130.0,定性離子對(duì)為m/z163.0>117.0,去簇電壓為80 V,碰撞電壓分別為25 V和35 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化選擇

首先比較了利用乙腈和甲醇分別作為有機(jī)相時(shí)的色譜出峰情況。結(jié)果表明,利用甲醇作為有機(jī)相時(shí)尼古丁存在一定的拖尾現(xiàn)象,而乙腈作為有機(jī)相時(shí)的峰形較好,無拖尾現(xiàn)象,色譜圖見圖1。

圖 1 尼古丁在甲醇和乙腈為有機(jī)相時(shí)的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of nicotine using methanoland acetonitrile as the organic phase

圖 2 尼古丁在酸性和堿性流動(dòng)相下的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of nicotine using acidicand alkaline mobile phases

另一方面,比較了流動(dòng)相條件中的酸堿性對(duì)尼古丁出峰的影響,采用乙腈作為有機(jī)相,分別比較了甲酸-水溶液(0.1∶99.9, v/v)和氨水-水溶液(0.1∶99.9, v/v)的出峰效果。結(jié)果表明,在酸性流動(dòng)相條件下,尼古丁能夠被電離,且具有較好的水溶性,因此在反相色譜柱上的保留較差[22],同時(shí)尼古丁在酸性條件下形成鹽,極性較大,呈現(xiàn)出雙峰形狀,而在堿性條件下峰形則較好,達(dá)到了較好的色譜分離效果(見圖2)。

2.2 尼古丁提取條件的優(yōu)化

2.2.1提取前加水體積的選擇

常見的野生食用菌主要包含新鮮樣品和經(jīng)烘干脫水后的干樣,對(duì)于新鮮食用菌樣品,可直接加入提取溶劑進(jìn)行提取,而對(duì)于干樣,常需要在加入提取溶劑前加入一定量的水,以使干樣潤濕吸水后恢復(fù)至新鮮狀態(tài),從而保證目標(biāo)化合物在干樣中的提取率與新鮮樣品一致。根據(jù)歐盟[23]對(duì)于農(nóng)藥檢測方法的要求,對(duì)于含水量低于10%的樣品,樣品稱樣量(g)與加水體積(mL)的比例應(yīng)為1∶2～1∶5。因此,本研究比較了稱樣量(g)與加水體積(mL)的比例分別為1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和1∶7時(shí)尼古丁的提取效果。結(jié)果表明,當(dāng)不加水時(shí),樣品無法潤濕,有機(jī)試劑難以進(jìn)入樣品細(xì)胞內(nèi)部,從而影響了目標(biāo)化合物的提取效率。隨著加水量的不斷增加,尼古丁的提取效率不斷增大。當(dāng)稱樣量(g)與加水體積(mL)的比例為1∶4和1∶5時(shí),提取效率達(dá)到最大,其后又隨著加水量的增大而降低。水相體積的不斷增大使得后續(xù)NaCl飽和步驟中的飽和度不斷降低,從而減小了尼古丁在有機(jī)相中的含量。綜合考慮后,選擇本試驗(yàn)中野生食用菌中稱取0.5 g干樣后加入2 mL水,可達(dá)到較好的提取效果。

2.2.2提取溶劑的選擇

圖 3 不同氨水和乙腈體積比對(duì)于尼古丁提取效率的影響Fig. 3 Effects of the different ammonia water and acetonitrile volume ratio on the extraction efficiencies of nicotine

尼古丁含有一個(gè)叔胺基團(tuán)和一個(gè)吡啶基團(tuán),其pKa值分別為8.2和3.1[24],表明尼古丁在不同的pH條件下的溶解性不同。常規(guī)情況下,尼古丁易溶于水等大極性溶劑,但是野生食用菌的水提物成分復(fù)雜,不利于后續(xù)的分析測定,因此,本研究中首先比較了甲醇和乙腈兩種常規(guī)溶劑在中性pH條件下的提取效果。結(jié)果表明這兩種溶劑的提取效率較差。又分別在甲醇和乙腈提取溶劑中加入0.1%的甲酸,提取效果仍然不好,尼古丁由于在酸性條件下具親水性而難以溶于有機(jī)相中。而在提取溶劑中加入0.1%的氨水可增大提取環(huán)境中的pH值,能夠有效抑制尼古丁在水中的溶解性,使其充分溶解于有機(jī)相中。綜合比較,堿性乙腈的提取效果比堿性甲醇的提取效果好。另一方面,比較了1%氨水、3%氨水、6%氨水、10%氨水和15%氨水-乙腈對(duì)尼古丁的提取效果。結(jié)果如圖3所示,當(dāng)氨水體積比達(dá)到6%和10%時(shí),提取效率達(dá)到最大(93%);其后隨著氨水比例的增大,提取效率降低。氨水體積的不斷增大,使得提取溶劑中水相比例增大而乙腈比例減小,影響了后續(xù)的NaCl飽和水相效果,不利于乙腈和水相的液液萃取過程,從而降低了尼古丁的提取效率。綜上,選取6%氨水-乙腈溶液作為提取溶劑。

2.2.3凈化填料的選擇

選取目前常用的GCB、NH2、C18、PSA和Florisil凈化填料,分別比較了其對(duì)尼古丁的凈化效果。結(jié)果表明,C18和Florisil凈化填料對(duì)于尼古丁具有一定的吸附作用,回收效果稍差(回收率為80%左右),而NH2和PSA填料對(duì)于尼古丁的凈化效果較好(回收率均為94%左右),其次為GCB(回收率為85%左右)。如圖4所示,GCB能夠有效除去提取液中的色素且不影響回收效果,其次為PSA。鑒于野生食用菌的種類繁多,基質(zhì)復(fù)雜,提取溶液大多含有色素及糖類物質(zhì),如果GCB的用量過多會(huì)對(duì)尼古丁有所吸附,而PSA對(duì)于尼古丁的吸附力較弱,且鑒于PSA能夠有效除去野生食用菌中的糖類物質(zhì),因此,確定將GCB和PSA作為混合填料共同對(duì)尼古丁提取溶液進(jìn)行凈化。

圖 4 不同凈化填料對(duì)于尼古丁提取溶液的凈化效果Fig. 4 Purification effects of different purificationfillers on nicotine extraction solution NH2: amino propyl; PSA:N-propylethylenediamine; GCB: graphitized carbon black.

比較了GCB和PSA不同配比對(duì)于尼古丁的凈化效果影響。比較了GCB和PSA分別為10 mg∶190 mg、30 mg∶170 mg、50 mg∶150 mg、70 mg∶130 mg和90 mg∶110 mg的不同凈化效果。結(jié)果表明,當(dāng)GCB加入量為10 mg和30 mg時(shí),對(duì)于提取液中的色素不能完全吸附,加入50 mg時(shí)能夠完全將提取溶液中的色素吸附,但是當(dāng)GCB的加入量繼續(xù)增多時(shí),則會(huì)對(duì)尼古丁有一定的吸附作用,綜上,選取GCB和PSA的添加量分別為50 mg和150 mg為優(yōu)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性范圍和檢出限

利用乙腈將尼古丁標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成不同的濃度,測定其峰面積,并以峰面積和相應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸;利用野生食用菌基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)并不斷降低加標(biāo)濃度,當(dāng)達(dá)到3倍和10倍信噪比(S/N)時(shí)所對(duì)應(yīng)的加標(biāo)濃度即為最低檢出限和定量限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,尼古丁在0.05～50.0 μg/L的范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)較好(r2=0.999 9),定量限為0.2 μg/kg,檢出限為0.05 μg/kg。

2.3.2回收率和精密度

分別以牛肝菌、羊肚菌和姬松茸為對(duì)象進(jìn)行回收試驗(yàn),加標(biāo)水平分別為1倍、5倍和10倍定量限,每個(gè)水平平行試驗(yàn)6次。結(jié)果如表2所示,尼古丁的平均回收率為86.3%～96.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.4%～6.3%。

表 2 尼古丁的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.4 實(shí)際樣品測定

采用本方法對(duì)云南省牛肝菌、羊肚菌、姬松茸和松茸等野生食用菌樣品中的尼古丁進(jìn)行測定,牛肝菌中尼古丁含量為0.038～1.011 mg/kg,羊肚菌中尼古丁含量為0.009～0.561 mg/kg,姬松茸中尼古丁含量為0.011～0.725 mg/kg,松茸中尼古丁含量為0.002～0.216 mg/kg。

3 結(jié)論

本文利用改進(jìn)的QuEChERS方法,系統(tǒng)探究了野生食用菌樣品復(fù)水量與提取率的關(guān)系,提取溶劑的選擇及凈化材料的選擇等,利用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜,建立了野生食用菌中尼古丁的快速高靈敏度測定方法,適用于目前食用菌產(chǎn)業(yè)中對(duì)尼古丁的快速檢測工作。