許艷豐 陳 瑤 劉 艷 楊萬根

吉首大學(xué)化學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所 湖南吉首 416000

傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品的加工周期一般較長(zhǎng)，為了縮短生產(chǎn)周期，降低成本，曾經(jīng)采用高溫成熟、添加蛋白酶和脂肪酶以及純種發(fā)酵等方法加速發(fā)酵肉制品的成熟[1,2]。其中，高溫成熟能促進(jìn)發(fā)酵肉中風(fēng)味物質(zhì)之間的反應(yīng)速度，提高酶的活力，但是高溫不利于發(fā)酵肉中有益微生物的生長(zhǎng)，所得產(chǎn)品品質(zhì)差[3～5]。純種發(fā)酵方法的主要優(yōu)勢(shì)是提高了產(chǎn)品的安全性，雖然接種發(fā)酵菌種能一定程度上縮短發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌的形成過程，但發(fā)酵優(yōu)勢(shì)微生物的生長(zhǎng)和蛋白酶、脂肪酶的作用仍然需要一段時(shí)間，因此成熟時(shí)間仍然較長(zhǎng)[6,7]。如何在保證發(fā)酵肉制品質(zhì)量前提下，有效縮短生產(chǎn)周期仍有待研究。根據(jù)前人的研究成果，將純種發(fā)酵和高溫成熟兩種方法的優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來，有可能縮短生產(chǎn)周期。此方法的原理是利用耐高溫發(fā)酵劑，在高溫下發(fā)酵肉制品，腐敗微生物因高溫和優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌種的作用受到抑制，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)因高溫而加速生成，從而加快發(fā)酵肉制品的成熟。然而，此法的前提是要篩選到適合高溫加工的耐高溫發(fā)酵劑。酵母菌是我國傳統(tǒng)肉制品中的一種有益菌。因此，本文從傳統(tǒng)方法加工的發(fā)酵肉中分離出酵母菌菌株，然后從中篩選耐高溫、耐鹽、耐亞硝酸鹽的酵母菌，并對(duì)其進(jìn)行種屬鑒定，為發(fā)酵肉加工新工藝的開發(fā)和發(fā)酵肉制品質(zhì)量與安全的提高提供菌種資源。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

臘肉，吉首市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購得；95%乙醇、蛋白胨、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、葡萄糖、瓊脂等，上海國藥集團(tuán)；TH15C酵母菌微量生化鑒定管，杭州濱和微生物試劑有限公司。

YXQ-SG46-280S手提式壓力蒸汽滅菌器，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；SPX-250B-Z恒溫生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；VS-1300L-U潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV755CRT紫外可見分光光度計(jì)，成都蘇凈科學(xué)器材有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌分離

取適量臘肉樣品，攪碎后加入到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，加入鏈霉素和四環(huán)素鹽酸鹽至終濃度為25mg/L，于30℃，150r/min搖床富集培養(yǎng)24h后，取1mL富集液，用無菌水稀釋成不同的倍數(shù)，涂布于YPD固體平板培養(yǎng)基上于30℃靜止培養(yǎng)24h，挑取單菌落，利用TTC雙層平板法進(jìn)一步篩選，把雙層平板放于30℃培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)24～48h，長(zhǎng)出菌落后，選擇顏色較深，具有典型酵母菌落特征的單菌落進(jìn)一步劃線分離2～3次，鏡檢為純種后轉(zhuǎn)入YPD固體斜面培養(yǎng)基中，于4℃保存[8～10]。

1.2.2 酵母菌篩選

1.2.2.1 產(chǎn)酒精能力測(cè)定

將上面篩選到的菌株分別接到Y(jié)PD平板上30℃培養(yǎng)24h，長(zhǎng)出菌落后將45℃TTC上層培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，30℃下避光保溫2～3h。觀察培養(yǎng)基顯色情況。產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母菌落一般為深紅色，次之為粉紅色，再者為微紅色。通過顏色深淺來比較各菌株的產(chǎn)酒精能力，篩選產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母菌株[11]。

1.2.2.2 耐鹽性測(cè)定

將分離的菌株接種到食鹽濃度為0%、2%、4%、6%、8%、10%的YPD液體培養(yǎng)基中，在30℃下培養(yǎng)24h，以YPD液體培養(yǎng)基做為空白對(duì)照，測(cè)定吸光值的變化，比較其生長(zhǎng)情況，選取生長(zhǎng)能力好的菌株進(jìn)入下一步的實(shí)驗(yàn)[12]。

1.2.2.3 耐亞硝酸鹽能力測(cè)定

將分離的菌株分別接種到亞硝酸鹽含量為50、100、150mg/kg的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h，測(cè)定吸光度值的變化，以YPD液體培養(yǎng)基做空白對(duì)照，比較其生長(zhǎng)情況，選取生長(zhǎng)能力好的菌株進(jìn)入下一步的實(shí)驗(yàn)[12]。

1.2.2.4 溫度梯度篩選

將前面篩選出來的單菌落分別接入滅菌的YPD液體培養(yǎng)基中，在37、42、50℃條件下160r/min搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后在600nm處測(cè)定培養(yǎng)液的吸光值，篩選50℃生長(zhǎng)較好的菌株。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 形態(tài)與培養(yǎng)特征

將菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3～7d，觀察是否發(fā)酵、培養(yǎng)液是否混濁，是否形成環(huán)或島，是否有沉淀及沉淀的松緊情況，并在顯微鏡下觀察菌體，記錄酵母菌細(xì)胞的形狀。將酵母菌在YPD平板上劃線，30℃培養(yǎng)3～4d，記錄其菌落形態(tài)。

1.2.3.2 生理生化鑒定

將篩選得到的菌株接種于酵母菌微量生化鑒定管中，37℃培養(yǎng)18～72h，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填寫在生化鑒定單上，并得出相應(yīng)的編碼值，通過編碼值檢索酵母菌菌屬細(xì)菌生化鑒定編碼表，鑒定菌株種屬。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母分離

從湘西臘肉中采集樣本，進(jìn)行涂布、劃線分離，得到40株酵母菌，編號(hào)為Y1～Y40。圖1為Y7的TTC培養(yǎng)基劃線分離圖。

圖1 經(jīng)過多次分離劃線的Y7菌落

2.2 酵母菌篩選

2.2.1 TTC法測(cè)定產(chǎn)酒精能力

TTC是一種顯色劑，它對(duì)酵母的代謝產(chǎn)物發(fā)生呈色反應(yīng)，通過它可以判斷酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母產(chǎn)酒精能力的高低。將培養(yǎng)在YPD平板上24h的酵母菌落上覆蓋一層TTC上層培養(yǎng)基，避光保溫2～3h后觀察，各株酵母菌的菌落或是不變色，或是呈現(xiàn)從淺粉到深紅的顏色。通過菌落顏色的深淺，可以初步判斷酵母菌產(chǎn)酒精能力的高低。從變色的菌株中，挑選出20株顏色深的酵母菌，編號(hào)為Y1、Y2、Y3、Y4、Y7、Y8、Y16、Y18、Y20、Y22、Y23、Y25、Y28、Y29、Y33、Y34、Y35、Y38、Y39、Y40。圖2為Y7的TTC培養(yǎng)基生長(zhǎng)圖。

圖2 Y7的TTC培養(yǎng)基生長(zhǎng)圖

2.2.2 耐亞硝酸鹽能力

如圖3所示，我們可以發(fā)現(xiàn)，隨著亞硝酸鹽濃度的增加，菌株的生長(zhǎng)開始逐漸減弱。綜合考慮，此實(shí)驗(yàn)排除了編號(hào)為Y3、Y18、Y38的菌株，余下編號(hào)為Y7、Y8、Y20、Y25、Y39、Y40的6株菌株進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。

圖3 酵母菌耐亞硝酸鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 測(cè)定耐鹽性能力

不同NaCl濃度液體培體物的吸光度值如圖4所示。

圖4 菌株對(duì)不同濃度NaCl的耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖4所示，在NaCl濃度為0%、2%時(shí)，酵母菌總體生長(zhǎng)良好，但Y1、Y2、Y16、Y22、Y23、Y28、Y29、Y34、Y35生長(zhǎng)比較弱，故而排除。在NaCl濃度為4%時(shí)，Y33的吸光值出現(xiàn)了明顯的降低，生長(zhǎng)較弱。在NaCl濃度為6%時(shí)，開始出現(xiàn)生長(zhǎng)非常緩慢的情況，其中Y4菌株測(cè)得的吸光值接近空白，幾乎不生長(zhǎng)，故而排除Y4。繼續(xù)提高鹽濃度至8%，Y3、Y8、Y18的吸光值出現(xiàn)負(fù)值，當(dāng)鹽濃度為10%時(shí)所有菌培養(yǎng)液的吸光值都為負(fù)值，說明這時(shí)酵母菌均不再生長(zhǎng)。為了提高獲得耐高溫菌株的成功概率，留下NaCl濃度為6%時(shí)生長(zhǎng)良好的Y3、Y7、Y8、Y18、Y20、Y25、Y38、Y39、Y40進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 溫度梯度篩選

溫度篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5。

圖5 培養(yǎng)溫度篩選結(jié)果

圖5顯示，隨著培養(yǎng)溫度的上升，菌株的生長(zhǎng)開始逐漸減弱。綜合考慮，此實(shí)驗(yàn)排除了編號(hào)為Y8、Y20、Y25、Y40的菌株，最后留下Y7和Y39做接下來的菌種鑒定實(shí)驗(yàn)。

2.3 菌種鑒定

依據(jù)菌落特征、菌體形態(tài)、生理生化特性等方法，將分離得到的耐高溫優(yōu)質(zhì)酵母菌鑒定到種屬。

2.3.1 形態(tài)與培養(yǎng)特征

Y7，Y39形態(tài)與液體培養(yǎng)特征見表1。

表1 Y7、Y39菌落形態(tài)與培養(yǎng)特征

2.3.2 生理生化鑒定

Y7、Y39的生理生化鑒定結(jié)果見表2。

表2 Y7、Y39生理生化鑒定結(jié)果

注：表中“+”為陽性，“-”為陰性。

根據(jù)酵母菌的形態(tài)學(xué)特征和表2中的生理生化特征，參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和酵母菌屬細(xì)菌生化鑒定編碼表，鑒定以上2株酵母菌分別為：Y7為熱帶念珠菌，Y39為乳酒念珠菌。

3 結(jié)論

本文從湘西臘肉中共分離出40株酵母菌，經(jīng)分離、篩選后得到2株耐高溫酵母菌，分別為Y7和Y39，經(jīng)過菌種鑒定后得出Y7為熱帶念珠菌，Y39為乳酒念珠菌。這些菌株有望用于發(fā)酵肉制品高溫加工工藝的開發(fā)。