大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心 遼寧大連 116600

表皮葡萄球菌是滋生于生物體表皮上的一種革蘭氏陽(yáng)性球菌，因常堆聚成葡萄串狀，故名表皮葡萄球菌。在自然發(fā)酵肉制品中，表皮葡萄球菌是占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位的葡萄球菌菌種[1～5]，它們?cè)诎l(fā)酵肉制品生產(chǎn)過(guò)程中能夠產(chǎn)生脂肪酶和蛋白酶，對(duì)發(fā)酵肉制品風(fēng)味品質(zhì)的形成起著重要作用[6]。葡萄球菌屬的許多種類(lèi)其菌落形態(tài)、菌體特征相似難辨，生理生化特性也存在許多相似之處，傳統(tǒng)的生理生化實(shí)驗(yàn)耗時(shí)費(fèi)力，不能滿足表皮葡萄球菌檢測(cè)中的快速、準(zhǔn)確、低成本的需要。

目前，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及PCR技術(shù)的出現(xiàn)，許多非培養(yǎng)方式鑒定技術(shù)被用于葡萄球菌的鑒定[7～9]。在眾多非培養(yǎng)方式鑒定方法中，特異性PCR技術(shù)以其快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單及低成本等優(yōu)點(diǎn)備受青睞，已得到了廣泛應(yīng)用[10]。而TaqMan探針的熒光PCR檢測(cè)具有定量準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、直觀的優(yōu)勢(shì)，在病原菌檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用[11]。因此本研究旨在采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立肉制品中表皮葡萄球菌檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

陽(yáng)性樣本CICC10294表皮葡萄球菌，陰性樣本金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、大腸埃希氏菌等20株標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。試驗(yàn)所用菌株見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)用菌株

Table 1 Test strains

序號(hào)名稱(chēng)來(lái)源菌種號(hào)1表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidisCICC102942金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusCICC216003鼠傷寒沙門(mén)氏菌Salmonella typhimuriumCICC214844大腸埃希氏菌Escherichia coliCICC103895蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereusCICC212616蕈狀芽孢桿菌Bacillus mycoidesCICC214737蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensisCICC229458枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisCICC102759銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosCICC2163610糞腸球菌 Enterococcus faecalisCICC2365811熒光假單胞菌Psdeuomnoda fluoerncnetCICC2162412惡臭假單胞菌Pseudomonas putidaCICC2054113福氏志賀氏菌Shigella flexneriCICC2153414產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridium perfringenCICC2294915白假絲酵母Candida albicansCICC196516產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacter aerogenesCICC2294917阪崎腸桿菌Enterobacter SakazakiiCICC2154418副溶血性弧菌Vibrio ParahemolyticusCICC2161719單核細(xì)胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenesCICC2163320馬紅球菌Rhodococcus equiCICC2295521釀膿鏈球菌Streptococcus pyogenesCICC10373

1.1.2 試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯等培養(yǎng)基為北京陸橋公司產(chǎn)品，DNA提取試劑盒為廣州雙螺旋公司產(chǎn)品，實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)試劑、Taq酶為寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 主要儀器

ABI QS7 Flex熒光定量PCR儀，Eppendorf 5427R超低溫離心機(jī)，上海一恒BWS-12恒溫水浴，Promega Quantus DNA分析儀。

1.2 方法

1.2.1 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)表皮葡萄球菌16S基因片段序列，用Primer express 3.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和一個(gè)TaqMan探針，探針的熒光標(biāo)記選擇FAM作為報(bào)告發(fā)光基團(tuán)，TAMRA為淬滅基團(tuán)。引物探針由上海生工公司合成。

表2 實(shí)時(shí)熒光PCR引物及探針序列

1.2.2 DNA模板的制備

將表皮葡萄球菌和其它菌株接種營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)24h。細(xì)菌增菌后，用DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA作為實(shí)時(shí)PCR的模板，-20℃保存。

1.2.3 實(shí)時(shí)PCR的反應(yīng)體系和條件

實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增采用25μL反應(yīng)體系，反應(yīng)用各種試劑采用寶生物工程(大連)有限公司的Premix Ex TaqTM(RR390Q)試劑盒，具體各種試劑濃度、體積見(jiàn)表2。

表3 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)：95℃變性5s、60℃退火和延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 特異性檢測(cè)

以金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、大腸埃希氏菌等20株細(xì)菌作為陰性對(duì)照，并用高純水作為無(wú)模板對(duì)照驗(yàn)證實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)表皮葡萄球菌的特異性。

1.2.5 靈敏度檢測(cè)

以0.85%生理鹽水將表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株做成菌懸液，對(duì)菌懸液進(jìn)行10倍比梯度稀釋?zhuān)纬商荻群繛?×106CFU/mL，1×105CFU/mL，1×104CFU/mL，1×103CFU/mL，1×102CFU/mL的菌懸液。對(duì)每個(gè)稀釋度取1mL菌懸液進(jìn)行DNA提取，提取的DNA則進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

選取市售涼拌豬耳朵、涼拌豬肚、生豬肉、醬牛肉、風(fēng)干牛肉共5個(gè)樣品，無(wú)菌取樣25g分別加入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)24h。取增菌液1mL提取DNA，利用本研究的實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR特異性結(jié)果

以金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、大腸埃希氏菌等20株細(xì)菌作為陰性對(duì)照，并用高純水作為無(wú)模板對(duì)照驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)表皮葡萄球菌的特異性。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)表皮葡萄球菌特異性試驗(yàn)見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，只有表皮葡萄球菌具有擴(kuò)增曲線，其他20種菌株無(wú)擴(kuò)增曲線。

圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)表皮葡萄球菌特異性試驗(yàn)Fig.1 Specificity detection ofqRT-PCR assay for Staphylococcus epidermidis

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏性結(jié)果

分別取1m表皮葡萄球菌1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL、1×102CFU/mL的菌懸液進(jìn)行DNA提取，提取的DNA進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)。表皮葡萄球菌靈敏性試驗(yàn)見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，表皮葡萄球菌濃度為1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL時(shí)均有擴(kuò)增曲線，濃度低于1×103CFU/mL時(shí)無(wú)擴(kuò)增曲線，該方法檢測(cè)的低限為1×103CFU/mL。

①1×106CFU/mL ②1×105CFU/mL ③1×104CFU/mL ④1×103CFU/mL圖2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)表皮葡萄球菌靈敏性試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity detection ofqRT-PCR assay for Staphylococcus epidermidis

2.3 實(shí)時(shí)PCR實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)涼拌豬耳朵、涼拌豬肚、生豬肉、醬牛肉、風(fēng)干牛肉共5個(gè)樣品的營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌液進(jìn)行DNA提取，以表皮葡萄球菌為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)。結(jié)果顯示，涼拌豬肚和生豬肉中檢測(cè)出含有表皮葡萄球菌(見(jiàn)圖3)。

1.蠟樣芽胞桿菌 2.生豬肉 3. 涼拌豬肚圖3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)樣品中試驗(yàn)Fig. 3 Detection of Staphylococcus epidermidis in samples by qRT-PCR

3 討論

在日常食品檢測(cè)中，表皮葡萄球菌一般不作為微生物檢驗(yàn)的常規(guī)指標(biāo)項(xiàng)目。但該菌抵抗力強(qiáng)，一般消毒劑對(duì)其無(wú)效，營(yíng)養(yǎng)要求低，容易在食品中存活并繁殖，存活時(shí)間長(zhǎng)，多數(shù)為非致病菌，少數(shù)可導(dǎo)致疾病。隨著人們生活水平的提高，對(duì)即食類(lèi)產(chǎn)品需求量不斷增加，要求不斷提高;加上不同的人群對(duì)病菌的抵抗能力不同就容易受到表皮葡萄球菌的影響。所以有必要對(duì)該菌進(jìn)行監(jiān)控，以提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低該菌引起食品污染的風(fēng)險(xiǎn)。

長(zhǎng)期以來(lái)，肉制品中表皮葡萄球菌檢測(cè)主要依據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定，該方法步驟繁瑣，且需要耗時(shí)數(shù)天的時(shí)間。常規(guī)PCR方法，雖然能夠大大縮短檢測(cè)周期，但其特異性較差，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性，且需要進(jìn)行核酸電泳、EB染色等步驟，危害操作人員的健康?；赥aqMan探針的熒光定量PCR檢測(cè)方法具有高特異性、高靈敏性和可計(jì)量性，自動(dòng)化程度高，無(wú)需電泳處理無(wú)污染性，且具有實(shí)時(shí)性、快速等特點(diǎn)[12]。

本研究設(shè)計(jì)含有不同濃度的表皮葡萄球菌(1×106CFU/mL，1×105CFU/mL，1×104CFU/mL，1×103CFU/mL，1×102CFU/mL)菌液樣品，試驗(yàn)得到該檢測(cè)方法的低限為1×103CFU/mL。本研究通過(guò)反復(fù)摸索，建立了一套切實(shí)可行的檢測(cè)食品中表皮葡萄球菌的方法，特異性試驗(yàn)和靈敏性試驗(yàn)良好，該檢測(cè)方法具有特異、快速的特點(diǎn)，能夠滿足檢測(cè)要求，為食品中表皮葡萄球菌的快速檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。