鄭肖蘭 鄭行愷 趙 爽 鄭 浩 陸翠梅 蔡秀清 ③

(1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所 海南?？?571101；2海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院 海南?？?570228；3農(nóng)業(yè)部熱帶農(nóng)林有害生物入侵監(jiān)測與控制重點開放實驗室 海南?？?571101；4海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物監(jiān)測與控制重點實驗室 海南?？?571101)

玉米(Zea mays L.)為禾本科玉米屬一年生草本植物[1]，經(jīng)濟(jì)價值很高，既可作糧食，也可用作工業(yè)原料和飼料。據(jù)考證，玉米栽培歷史已有七千多年，是全世界分布最廣種植最多的糧食作物之一。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，全球玉米的需求量均持續(xù)增長，是種植面積和產(chǎn)量增長最快的主要糧食品種之一。在中國的播種面積位居第三，僅次于谷類作物小麥和水稻，在世界上僅次于美國[2]。全世界主要在熱帶和溫帶地區(qū)種植廣泛，海南因可播種冬玉米而成為中國玉米重要的南繁育種基地。因此，玉米在中國經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有重要地位，必須把保障玉米生產(chǎn)安全作為重中之重。作為中國第三大糧食作物，病蟲害問題一直都是玉米穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的限制因素，而玉米彎孢霉葉斑病是海南省南繁種植區(qū)最嚴(yán)重的玉米葉部病害之一。據(jù)研究資料，在生產(chǎn)上，玉米因病害造成的損失可達(dá)6%～10%，嚴(yán)重時達(dá)到30%以上[3]。中國玉米病害主要有30余種，按其侵染類別可分為寄生性病害和非寄生性病害2類。玉米寄生性病害有小斑病、大斑病、莖腐病、枯萎病、矮花葉病毒病、根結(jié)線蟲、根腐線蟲病等。不適宜的生長條件都可能導(dǎo)致非寄生性病害的發(fā)生[2]。通過對玉米病害進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由Curvularia lunata Boedijn引起的玉米彎孢霉葉斑病是夏玉米的主要病害，該病主要發(fā)生在熱帶及亞熱帶地區(qū)。據(jù)報道，在中國，彎孢霉葉斑病最早發(fā)生于水稻、高粱等作物[4]。自 1956年 Nel-son首次報道由彎孢霉菌引起玉米葉斑病，相繼在美國、南斯拉夫、意大利、巴西、泰國、印度等國外玉米栽培區(qū)流行，并造成重大損失[5]。20世紀(jì)80年代初，在中國山東沿海地區(qū)曾有關(guān)于玉米彎孢菌葉斑病的報道，但未能確定其病原菌種類。1994年北京夏玉米重度發(fā)生了玉米彎孢菌葉斑病，發(fā)病率達(dá)60%。90年代中后期，在中國華北、東北玉米主產(chǎn)區(qū)該病發(fā)病較嚴(yán)重，群眾開始稱這種病害為黃斑病，通過對黃斑病病原進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，黃斑病的病原為新月彎孢霉[6]。

2010年玉米彎孢霉葉斑病在鄭州市中度偏輕發(fā)生，局部中偏重發(fā)生，發(fā)生面積達(dá) 2.93萬hm2，占玉米種植面積的19.2%，較往年重，發(fā)生盛期最高病株率、病葉率均達(dá)100%[7]。由于耕作制度的變更、品種的更換及全球氣候變暖等原因，玉米彎孢菌葉斑病已成為嚴(yán)重危害玉米的重要病害之一[8]。目前國外學(xué)者的研究主要集中在病害造成的損失、玉米品種抗病性、彎孢菌生物學(xué)和致病作用及病害發(fā)生規(guī)律等方面的研究。趙來順等[9]根據(jù)病斑的大小、顏色、形狀以及產(chǎn)孢狀況等特征，將玉米彎孢菌葉斑病的癥狀類型分成抗病型(R)、中間型(M)和感病型(S)3種。目前，從中國該病發(fā)生及危害的情況來看，重點防治對象為新月彎孢氣生變種，即其優(yōu)勢致病菌。據(jù)Marci等[10]報道，該變種產(chǎn)生的毒素屬于非寄主?；远舅?。呂國忠[11]、趙來順等[9]也報道，玉米彎孢菌可以產(chǎn)生毒素，且毒素對寄主種子的萌發(fā)及胚根和胚芽生長都有抑制作用，可使幼苗枯死。

以往的研究區(qū)域均屬于溫帶亞熱帶地區(qū)，而且都是針對玉米病蟲害進(jìn)行調(diào)查和病原的生物學(xué)特性及防治方法進(jìn)行研究，而關(guān)于南方繁殖育種區(qū)玉米病害的相關(guān)研究尚未見報道。本研究特對熱帶地區(qū)海南南繁種植區(qū)玉米病蟲害進(jìn)行調(diào)查，期間筆者團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)玉米彎孢霉葉斑病普遍發(fā)生。鑒于與以往報道該病害的地域差異大，促使筆者通過柯赫氏法則、生長速率測定法和血球計數(shù)板計數(shù)法等對此病害進(jìn)行生物學(xué)特性方面的研究，為南繁區(qū)玉米彎孢霉葉斑病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

玉米彎孢霉葉斑病葉片，采集于三亞南濱農(nóng)場南繁玉米種植基地。

1.1.2 供試菌

玉米彎孢霉葉斑病病菌C24，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所分離純化保存。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

PSA、PDA、Czapek、PSA＋玉米綠葉煎汁、玉米綠葉煎汁、PDA+玉米綠葉煎汁、燕麥。

1.1.4 供試試劑

瓊脂，葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，乳糖，D-果糖，D-木糖，可溶性淀粉，L-絲氨酸，L-精氨酸，L-谷氨酰胺，L-賴氨酸，L-亮氨酸， L-纈氨酸，L-脯氨酸， 甘氨酸，蘇氨酸， CaCO3，MgSO4·H2O，K2HPO4， KCl， NaNO3， FeSO4·7H2O， 四環(huán)素， 鏈霉素，HCl，NaOH等。

1.1.5 儀器設(shè)備

培養(yǎng)皿，錐形瓶，打孔器，酒精燈，超凈工作臺，顯微鏡，恒溫培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌鍋，鑷子，電子天平等。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

PSA、PDA、Czapek、PSA＋玉米綠葉煎汁、玉米綠葉煎汁、PDA＋玉米綠葉煎汁、燕麥培養(yǎng)基成分及制備方法參考鄭肖蘭方法[12]。

各種培養(yǎng)基如果需要加入抗生素，則待培養(yǎng)基冷卻至40～60℃，加入四環(huán)素(Tetracycline，Tet)50 μg/mL、 鏈霉素(Streptomycin， Str)100 μg/mL，搖勻倒平板備用。

1.2.2 樣本采集、處理及分離培養(yǎng)

從三亞市南濱農(nóng)場南繁玉米種植基地采集玉米彎孢霉葉斑病病葉，分裝于封口樣品袋中帶回實驗室進(jìn)行保濕、鏡檢和分離培養(yǎng)等處理。參考鄭肖蘭等[13]分離方法，待長出菌落后移植到PDA平板上純化、編號、保存，待鑒定。

1.2.3 病原菌的單孢分離

參照鄭肖蘭等[13]分離方法，使用滅菌牙簽挑取含單孢的瓊脂塊放入PDA平板培養(yǎng)基，28℃下培養(yǎng)5d。

1.2.4 病原菌鑒定

(1)病原菌的形態(tài)特征觀察和分離菌的驗證參照鄭肖蘭等方法[12]；(2)真菌ITS保守序列擴(kuò)增采用真菌ITS區(qū)段的通用引物 ITS1和ITS4；C24菌絲體收集及基因組提取、PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測及后續(xù)的測序分析均參考鄭肖蘭等[14]方法。

1.2.5 病原菌生物學(xué)特性研究

下列研究均參照鄭肖蘭等方法[12]。

(1)培養(yǎng)基對C24菌絲生長影響測定；

(2)不同溫度對參試菌C24菌絲生長影響測定；

(3)不同pH值對參試菌C24菌絲生長影響測定；

(4)不同碳源對參試菌C24菌絲生長影響測定；

(5)不同氮源對參試菌C24菌絲生長影響測定；

(6)光照對參試菌C24菌絲生長影響測定。

1.2.6 病原菌孢子形態(tài)觀察 取菌株C24菌餅接種至100 mL的PDB液體培養(yǎng)基(成分除不添加瓊脂外其余與PDA相同)中，在28℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，觀察孢子形態(tài)及大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)玉米彎孢菌主要侵染玉米葉片，也可危害玉米葉鞘和苞葉。初生褪綠小斑點，逐漸擴(kuò)展為圓形至橢圓形褪綠透明斑，病斑中間呈枯白色或黃褐色，四周有半透明淺黃色暈圈，邊緣有較細(xì)的褐色環(huán)帶，一般大小(0.5～4.0)×(0.5～2.0)mm，大的可達(dá)7.0×4.0 mm(圖1)。濕度大時，病斑在玉米葉片正、反面均可產(chǎn)生灰黑色霉?fàn)钗?，即病原菌的分生孢子和分生孢子梗。發(fā)病嚴(yán)重時，病斑密布整片葉片，形成大面積壞死，直至整個葉片干枯死亡。

2.2 病原菌C24的形態(tài)學(xué)鑒定

圖1 玉米彎孢霉葉斑病的癥狀

玉米彎孢菌C24在PDA培養(yǎng)基上菌落初始為灰白色，但隨著菌落培養(yǎng)時間增加，分生孢子梗呈淡褐色至深褐色，有橫隔，較直，孢痕明顯 （圖2）。分生孢子呈黑褐色，橢圓形或梭形，一般有3個隔膜，兩端細(xì)胞鈍圓，顏色較淡且稍小，而中部2個細(xì)胞顏色最深且較大(圖3)。

圖2 PDA培養(yǎng)基上菌株C24的菌落形態(tài)

圖3 菌株C24的分生孢子形態(tài)

2.3 病原菌對玉米葉片的致病性

玉米葉片接種菌株C24后，第3天葉片產(chǎn)生病斑(圖4)，病斑中間黃褐色，四周有半透明淺黃色暈圈，產(chǎn)生灰黑色霉?fàn)钗铩＝?jīng)比較可知，將從發(fā)病病斑中分離的病原菌接種至健康玉米葉片后的發(fā)病癥狀與田間表現(xiàn)相似，分離后獲得的病原菌與原分離菌株相同，這些結(jié)果表示供試菌株C24為玉米葉斑病的病原菌。

2.4 病原菌的分子鑒定

圖4 菌株C24對玉米葉片的致病性測定

菌株C24的rDNA-ITS保守序列擴(kuò)增結(jié)果見圖5。參試樣品均能擴(kuò)增出特異條帶。經(jīng)NCBI網(wǎng)站比對可知，菌株C24的rDNA-ITS擴(kuò)增序列與Curvularia及Cochliobolus屬中幾株真菌序列相似性較高。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示(圖6)，供試菌株C24與 GenBank中的 Curvularia lunata strain CX-3、Cochliobolus geniculatus、Curvularia lunata isolate CL-1等親緣關(guān)系較近，其中與Curvularia lunata和Curvularia lunata strain CX-3序列同源性達(dá)到99%以上。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察，將致病菌鑒定為玉米彎孢霉菌(Curvularia lunata)，屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色孢科、彎孢屬、彎孢菌。

圖5 C24的ITS保守區(qū)PCR擴(kuò)增電泳圖

2.5 不同培養(yǎng)基對菌株C24菌落生長的影響

圖6 基于菌株C24的rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖7 不同培養(yǎng)基對菌株C24菌落生長的影響

不同培養(yǎng)基對玉米彎孢菌C24菌落生長影響見圖7。菌株C24在PSA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、Cza pek培養(yǎng)基、PSA＋玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基、玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基、PDA＋玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基等7種培養(yǎng)基上，25℃恒溫下均能生長，然而不同培養(yǎng)基對菌落生長速度及形態(tài)影響差異顯著。其中在燕麥培養(yǎng)基上生長最快，且菌落致密平展，絨狀，菌落正面墨綠色，背面棕色，邊緣整齊，所以較適合該菌株菌落生長的是燕麥培養(yǎng)基，其次是玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基，再次為PSA＋玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基和PDA＋玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基，整體來說，該菌株在這些培養(yǎng)基上形成的菌落形狀較不規(guī)則，邊緣不整齊；在Czapek培養(yǎng)基上菌落雖生長速度適中，但菌落不致密，氣生菌絲稀疏，灰白色；而在PDA培養(yǎng)基和PSA培養(yǎng)基上生長速度緩慢，這3種培養(yǎng)基均不適合菌落生長。同時試驗發(fā)現(xiàn)，病原菌在PSA、PDA、PSA＋玉米綠葉煎汁、玉米綠葉煎汁和Czapek培養(yǎng)基上易產(chǎn)孢，且在PDA上產(chǎn)孢量最多，而在PDA＋玉米綠葉煎汁和燕麥培養(yǎng)基上未見產(chǎn)孢，由此可知PDA培養(yǎng)基較適合該菌產(chǎn)孢。

2.6 不同溫度對菌株C24菌落生長的影響

不同溫度對玉米彎孢菌菌株C24菌落生長的影響見圖8。菌株C24在10～41℃均可生長，15℃以下時生長較慢，15～25℃該菌株的生長速度趨于穩(wěn)定，而28～37℃生長速度最快，41℃時菌落生長速度有所下降。從結(jié)果推測C24適宜溫度較廣泛，相對更適合中溫偏高的環(huán)境。

2.7 不同pH值對參試菌C24菌落生長的影響

圖8 溫度對菌株C24菌落生長的影響

不同pH值對玉米彎孢菌C24菌落生長影響見圖9。不同pH對菌落生長速度影響差異顯著。菌株C24在pH5～11均能生長，以pH 7～9菌落生長速度較快，而pH為5時該菌的生長速度最慢。

2.8 不同碳源對參試菌C24菌落生長的影響

不同碳源對玉米彎孢菌C24菌落生長影響見圖10。試驗結(jié)果表明，病原菌除了在以木糖、乳糖、蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上生長不好外，在其他培養(yǎng)基上都可以較好地生長，但在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上生長最快。此外，除在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上菌落生長速度快于無碳源的對照以外，在其他6種碳源培養(yǎng)基上的生長速度均低于對照，但其氣生菌絲密集度均高于對照；對照氣生菌絲極少且貼著培養(yǎng)基表面伸展生長，無氣生菌絲。而與無碳源的對照相比，碳源為可溶性淀粉和麥芽糖的培養(yǎng)基最適合菌落生長。

圖9 不同 pH對菌株C24菌落生長的影響

圖10 不同碳源對菌株C24菌落生長的影響

2.9 不同氮源對參試菌C24菌絲生長的影響

不同氮源對玉米彎孢菌株C24菌落生長影響見圖11。該菌株在含不同氮源的培養(yǎng)基上的生長速度存在顯著差異。與硝酸鈉對照相比，氮源為L-亮氨酸的培養(yǎng)基最適合該菌落生長，在以L-精氨酸為氮源的培養(yǎng)基上菌落生長速度最慢。試驗同時發(fā)現(xiàn)，菌株C24在以甘氨酸為氮源的固體培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，在其它培養(yǎng)基未見產(chǎn)孢。

2.10 光照對參試菌C24菌落生長的影響

光照對玉米彎孢菌C24菌落生長的影響見圖12，與黑暗條件相比，光照對菌落生長影響顯著，說明光照有利于菌落生長。

3 討論

圖11 不同氮源對菌株C24菌落生長的影響

圖12 光照對菌株C24菌落生長的影響

本研究采用常規(guī)組織分離法對采集的玉米彎孢霉葉斑病的病原菌C24進(jìn)行分離純化鑒定。結(jié)果表明，分離的病原菌C24接種至健康玉米葉片后，葉片產(chǎn)生的病斑與自然發(fā)病的病斑相同，且從發(fā)病的玉米葉片中分離出的病原菌與原分離菌株相同，結(jié)果顯示參試菌株C24為玉米彎孢霉葉斑病的病原菌。

通過對玉米彎孢霉葉斑病菌C24生物學(xué)特性進(jìn)行研究可知，該病原菌在PSA、PDA、Czapek、PSA＋玉米綠葉煎汁、玉米綠葉煎汁、PDA＋玉米綠葉煎汁、燕麥等7種培養(yǎng)基上，25℃恒溫下均能生長，且在燕麥培養(yǎng)基上菌絲生長速度較快，而在PDA培養(yǎng)基和PSA培養(yǎng)基上菌落生長較慢。同時試驗發(fā)現(xiàn)，病原菌在PDA、PSA、玉米綠葉煎汁、PSA＋玉米綠葉煎汁和Czapek培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，且在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最多，說明該培養(yǎng)基較適合孢子生長。結(jié)合培養(yǎng)基配制、菌絲生長速率、產(chǎn)孢情況等綜合分析，總體來說PDA培養(yǎng)基較為適合用于菌株C24的培養(yǎng)。

菌株C24的較適溫度在28～37℃。白元俊等關(guān)于玉米彎孢霉葉斑病菌的生物學(xué)特性研究表明，該菌最適溫度為30～32℃；白元俊等[15]、朱明旗等[16]關(guān)于玉米彎孢霉葉斑病的生物學(xué)特性研究表明，最適溫度為25～30℃，這與本研究結(jié)果略有差異；此外，張定法等[17]對玉米彎孢霉葉斑病生物學(xué)特性的研究表明，菌絲生長的適宜溫度為25～35℃，這與本研究結(jié)果基本一致，推測南繁區(qū)處于熱帶地區(qū)，常年高溫，導(dǎo)致病原菌彎孢霉適應(yīng)較高溫天氣。

本研究發(fā)現(xiàn)，菌株C24適應(yīng)pH范圍較廣，在pH 5～11均能生長，菌絲生長的最適pH為7～9，這與梅麗艷等[18]的研究結(jié)果略有差異，其研究表明，pH為6～8時適宜菌落生長，最適pH為7，pH為6～8時產(chǎn)孢量最大。

光照對菌株C24菌落的生長影響顯著。本研究結(jié)果顯示，光照有利于菌落生長，這與白元俊等[15]研究結(jié)果存在差異。

此外，不同的碳源和氮源對該病原菌的生長影響差異較大。與對照相比，以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基最適合該菌落生長，這與朱明旗等[16]的研究結(jié)果基本一致。氮源為 -亮氨酸的培養(yǎng)基最適合菌落生長，以 -精氨酸為氮源的培養(yǎng)基較不適合菌落生長，且病原菌只在以甘氨酸為氮源的固體培養(yǎng)基上產(chǎn)孢。

綜上所述，本研究結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果既有相同之處又有不同之處，可能的原因是由于地域不同，導(dǎo)致病原菌的生物學(xué)特性有所差異。鑒于玉米彎孢霉葉斑病在玉米上造成較大危害，下一步工作重點對該病發(fā)生規(guī)律以及抗病品種培育等防治措施開展系統(tǒng)、深入的研究，以有效控制玉米彎孢霉葉斑病的危害。

4 結(jié)論

本研究以玉米彎孢霉葉斑病菌C24作為研究對象，對其進(jìn)行生物學(xué)特性研究，得到該病原菌在燕麥培養(yǎng)基上生長最好，最適溫度在28～37℃，最適pH為7～9，光照有利于菌絲生長，碳源為麥芽糖、氮源為L-亮氨酸的培養(yǎng)基最適合該菌落生長。