肖明 周雅琪 李芳嬋

[摘要] 目的 建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定六味葛藍(lán)降脂片中的葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚的含量。 方法 采用高效液相色譜法，色譜柱Phenomenex Gemini C18（250 nm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min。 結(jié)果 葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚進(jìn)樣量分別在0.01 458～0.06 562 mg/mL、0.1074～0.2417 mg/mL、0.014 58～0.065 62 mg/mL、0.012 01～0.054 04 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r = 0.995 94、0.999 95、0.999 97、0.991 57）；平均加樣回收率分別為99.0%、102.9%、104.1%、104.1%，RSD分別為0.390%、0.910%、0.050%、0.057%（n = 6）。 結(jié)論 本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，方法穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可用于六味葛藍(lán)降脂片的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜；六味葛藍(lán)降脂片；葛根素；大豆苷元；橙黃決明素；大黃酚

[中圖分類號(hào)] R286.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）04（c）-0105-05

Simultaneous determination of puerarin， daidzein， aurantio-obtusin and chrysophanol in Liuwei Gelan Jiangzhi Tablets by HPLC

XIAO Ming1 ZHOU Yaqi2 LI Fangchan3 JIANG Lin3 WEI Bowei2

1.Health Food Branch of Guangxi Zhuang Yao Pharmaceutical Engineering Technology Research Center， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530023， China； 2.Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China； 3.School of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of puerarin， daidzein， aurantio-obtusin and chrysophanol in Liuwei Gelan Jiangzhi Tablets. Methods High performance liquid chromatography method was used. Phenomenex Gemini C18 （250 nm × 4.6 mm， 5 um） was used as the chromatographic column. The mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution. The gradient elution method was used. The detection wavelength was 285 nm， the column temperature was 30℃， and the flow rate was 1.0 mL/min. Results The injection quantities of puerarin， daidzein， aurantio-obtusin and chrysophanol showed good linear relationship with peak area in the range of 0.014 58-0.065 62 mg/mL， 0.1074-0.2417 mg/mL， 0.014 58-0.065 62 mg/mL， 0.012 01-0.054 04 mg/mL （r = 0.995 94， 0.999 95， 0.999 97， 0.991 57）， respectively， and the average recovery rates were 99.0%， 102.9%， 104.1%， 104.1%， and RSD were 0.390%， 0.910%， 0.050%， 0.057% （n = 6）， respectively. Conclusion The method is simple， accurate， stable and reproducible. It can be used for the quality control of Liuwei Gelan Jiangzhi Tablets.

[Key words] High performance liquid chromatography； Liuwei Gelan Jiangzhi Tablets； Puerarin； Daidzein； Aurantio-obtusin； Chrysophanol

近年來(lái)，高脂血癥發(fā)病率呈明顯增高和年輕化的趨勢(shì)，在飲食控制的基礎(chǔ)上使用保健食品調(diào)整血脂水平，對(duì)防治心腦血管疾病具有重要意義[1-4]。六味葛藍(lán)降脂片是由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠開(kāi)發(fā)的具有輔助降血脂功效的產(chǎn)品，其由絞股藍(lán)、火麻仁、決明子、葛根、沙棘和荷葉六味藥食同源藥材配伍而成。原標(biāo)準(zhǔn)僅以單指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量控制，難以控制中藥復(fù)方的整體質(zhì)量[5]。方中主藥決明子和葛根具有降血脂和改善心腦血管循環(huán)等作用[6-8]。其中決明子的降血脂代表性成分有大黃酚和橙黃決明素[9-11]。葛根降血脂的代表性成分有葛根素、大豆苷元[12-15]。本研究采用高效液相色譜法對(duì)六味葛藍(lán)降脂片中橙黃決明素、大黃酚、葛根素和大豆苷元4種藥效成分進(jìn)行含量測(cè)定，建立控制指標(biāo)，以期為全面考察六味葛藍(lán)降脂片內(nèi)在質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent-1260高效液相色譜儀、Alltech1260-UV型紫外檢測(cè)器、KQ5200型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、TGL-16G離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、SQP型電子天平[百萬(wàn)分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.2 試藥

葛根素對(duì)照品（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：170109，純度為>98%）、大豆苷元對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-17101202，純度為99.99%）、橙黃決明素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111900-201303，純度為99.1%）、大黃酚對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-17041310，純度為99.50%）。甲醇、乙醇、磷酸（分析純）、乙腈（色譜純）。

六味葛藍(lán)降脂片樣品（規(guī)格：2 g/片，批號(hào)：20170501、20170601、20170602、20170603、20170701、20170801、20170802、20170803、20170901、20171001）均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Phenomenex Gemini C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）；按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：15 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品制備 精密稱取葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚對(duì)照品適量，以甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為葛根素1.027 mg/mL、大豆苷元1.030 mg/mL、橙黃決明素1.045 mg/mL及大黃酚1.102 mg/mL的混合對(duì)照儲(chǔ)備液；另取上述溶液適量，置于同一量瓶中，加甲醇制成含葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚濃度分別為0.1535、0.03413、0.05104、0.04203 mg/mL混合對(duì)照品溶液，避光冷藏保存。

2.2.2 供試品溶液制備 取重量差異項(xiàng)下的六味葛藍(lán)降脂片20片，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，搖勻，過(guò)濾，揮干，用適量95%乙醇溶解并定容置5 mL容量瓶，搖勻，過(guò)濾，離心半徑8 cm，13 000 r/min離心10 min，取濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 按六味葛藍(lán)降脂片處方比例稱取缺葛根和決明子的藥材，分別按處方工藝提取，再按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，對(duì)照品色譜中與樣品色譜在相同保留時(shí)間處都有色譜峰，而陰性対照液中無(wú)相應(yīng)峰，提示樣品中其他成分對(duì)葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚成分的測(cè)定無(wú)干擾，理論塔板數(shù)均>5000，拖尾因子均在0.95～1.05，分離度均>1.5。見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密取上述混合對(duì)照品溶液適量，分別配成葛根素濃度為0.043 87、0.087 74、0.1316、0.1535、0.1755、0.1974 mg/mL，大豆苷元濃度為0.009 750、0.019 50、0.024 38、0.034 13、0.039 01、0.043 88 mg/mL，橙黃決明素濃度為0.014 58、0.029 17、0.043 75、0.058 33、0.065 62 mg/mL，大黃酚濃度為0.012 01、0.024 02、0.036 03、0.042 03、0.048 04、0.054 04 mg/mL的溶液；按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 中間精密度試驗(yàn)

取上述混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚的峰面積，其RSD分別為1.30%、0.99%、0.99%、0.66%。提示儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取六味葛藍(lán)降脂片樣品（批號(hào)：20170801）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD。葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚的RSD分別為1.90%、0.52%、1.80%和2.10%。提示供試品溶液中的4個(gè)成分在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取六味葛藍(lán)降脂片樣品（批號(hào)：20170801），平行6份，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算。結(jié)果6份樣品中葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚的平均含量分別為0.7975 mg/g、0.1608 mg/g、0.2342 mg/g、0.1721 mg/g，RSD分別為3.7%、2.5%、2.9%、3.1%。提示本法重復(fù)性較好。

2.8加樣回收率

取同一批含量已知的六味葛藍(lán)降脂片樣品（批號(hào)：20170801）粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入葛根素、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚對(duì)照品0.3260、0.0724、0.0996、0.0860 mg，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果葛根素、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚的平均加樣回收率分別為99.0%、102.9%、104.1%、104.1%。提示該方法準(zhǔn)確性較好。見(jiàn)表3。

2.9 樣品含量測(cè)定

取10批六味葛藍(lán)降脂片樣品粉未，平行3份，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算葛根素、大豆苷元、橙黃決明素和大黃酚的含量。綜合原藥材來(lái)源差異，擬制訂葛根素、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚含量限度分別不少于0.8702、0.1920、0.2938、0.2188 mg/片。見(jiàn)表4。

3 討論

10批六味葛藍(lán)降脂片中葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚的含量均存在一定差異。通過(guò)分析，認(rèn)為可能是由于不同批次六味葛藍(lán)降脂片的原藥材產(chǎn)地不同，其成分含量不同所致。為更好地控制該制劑含量，應(yīng)從藥材源頭開(kāi)始，并在整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中嚴(yán)格進(jìn)行質(zhì)量控制，才能更好地保證制劑的質(zhì)量。本研究建立的高效液相色譜法可同時(shí)測(cè)定制劑中多個(gè)不同指標(biāo)成分，該方法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性及穩(wěn)定性均較好。與原標(biāo)準(zhǔn)[5]比較，具有分離效果好、簡(jiǎn)單快速的測(cè)定多種成分的優(yōu)點(diǎn)，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。決明子和葛根為六味葛藍(lán)降脂片中輔助降血脂功效的重要組成，決明子中的大黃酚和橙黃決明素為降血脂的主要活性成分，可以作為六味葛藍(lán)降脂片的質(zhì)量標(biāo)志物之一[16-17]。葛根中的葛根素能降低血清總膽固醇，調(diào)節(jié)膽固醇血癥患者的血脂水平，是葛根降血脂的重要活性成分[18-19]。大豆苷元對(duì)心血管具有保護(hù)作用，可以作為產(chǎn)品質(zhì)量控制指標(biāo)[20-21]。本研究選擇葛根素、大豆苷元、橙黃決明素及大黃酚4種成分作為指標(biāo)成分對(duì)六味葛藍(lán)降脂片進(jìn)行質(zhì)量控制，為六味葛藍(lán)降脂片的研制與開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

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（收稿日期：2018-05-30 本文編輯：王 蕾）