李永生 張春玲 楊媛媛

[摘要] 目的 建立同時(shí)測(cè)定紅曲中尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷7種核苷類成分的高效液相色譜法。 方法 采用Shiseido C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈（A）-0.05 mol/L磷酸二氫鉀（B）二元線性梯度洗脫：0～9 min，0 %A；9～40 min，0%～8%A；流速1 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量20 μL。 結(jié)果 尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷分別在1.00～5.00 μg、3.08～15.35 μg、2.78～13.95 μg、9.37～46.87 μg、4.58～22.86 μg、1.06～5.29 μg、4.41～22.28 μg與其峰面積呈良好的線性關(guān)系（r ≥ 0.9995），平均加樣回收率分別為99.34%、99.56%、100.18%、97.95%、98.34%、98.02%、99.28%，RSD < 2.00%。 結(jié)論 該方法重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確精密，可用于紅曲中核苷類成分含量測(cè)定及質(zhì)量評(píng)價(jià)。

[關(guān)鍵詞] 紅曲；核苷；高效液相色譜；含量測(cè)定；質(zhì)量控制

[中圖分類號(hào)] R151 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）04（c）-0101-04

Determination of 7 nucleosides in red yeast rice by HPLC

LI Yongsheng1 ZHANG Chunling1 YANG Yuanyuan2 CHEN Zhiyon1，3

1.Department of Pharmacy， Honghui Hospital， Xi′an Jiaotong University of Medicine School， Shaanxi Province， Xi′an 710054， China； 2.Xi′an Institute for Food and Drug Control， Shaanxi Province， Xi′an 710054， China； 3.Institute of Chinese Materia Medica， Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine， Shaanxi Province， Xi′an 710003， China

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of seven nucleosides of uracil， cytidine， hypoxanthine， adenine， inosine， thymidine and adenosine in red yeast rice. Methods Shiseido C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm） was adopted to separate the sample at the column temperature of 25°C. Acetonitrile （A）-0.05 mol/L KH2PO4 （B） was used as the mobile phase. Gradient elution method： 0-9 min， 0% A； 9-40 min， 0%-8% A. The injection volume was 20 μL， and flow rate was 1 mL/min. The detection wavelength was 254 nm. Results Uracil， cytidine， hypoxanthine， adenine， inosine， thymidine and adenosine showed a good linear relationship with the peak area （r < 0.9995） in the range of 1.00-5.00 μg， 3.08-15.35 μg， 2.78-13.95 μg， 9.37-46.87 μg， 4.58-22.86 μg， 1.06-5.29 μg， 4.41-22.28 μg， respectively. The average recovery rates were 99.34%， 99.56%， 100.18%， 97.95%， 98.02%， 99.28%， RSD < 2.00%. Conclusion The method is reproducible and accurate， and can be used for the determination and quality evaluation of nucleotide in red yeast rice.

[Key words] Red yeast rice； Nucleosides； High performance liquid chromatography； Content determination； Quality control

紅曲性溫、味甘，具有活血化瘀、健脾消食之功效，臨床主治產(chǎn)后惡露不凈、瘀滯腹痛、食積飽脹等癥[1-2]。曲霉科真菌紫色紅曲菌Monascus purpureus Went的菌絲及孢子在粳米內(nèi)部生長(zhǎng)，使整個(gè)米粒變成紅色，即為紅曲[3]。現(xiàn)代藥理研究[4-6]表明，紅曲既能降血脂、降血壓，又具有防止骨質(zhì)疏松、老年癡呆，抑制Aβ40神經(jīng)毒等作用。紅曲中主要含有酶類、色素、Monacolin類及核苷酵素等[1]。

紅曲現(xiàn)有的含量測(cè)定主要以洛伐他汀為主[7-9]。核苷類物質(zhì)具有廣泛生理活性，參與DNA代謝過程，并具有抑制腫瘤、抗病毒等多種活性[10]。免疫細(xì)胞具有更新代謝迅速的特點(diǎn)，在內(nèi)源性核苷酸無法滿足生理需求時(shí)，通過外源性核苷酸的補(bǔ)充，特別是藥物及膳食中的核苷酸，也可參與到機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中[11]。其中，肌苷對(duì)糖尿病性膀胱病具有保護(hù)作用[12]；尿嘧啶和次黃嘌呤對(duì)單胺氧化酶具有抑制作用[13-14]；腺苷具有舒血管降壓、降低心率、鎮(zhèn)靜抗驚厥作用[15]。核苷作為一類中藥的有效成分，在中藥及中成藥質(zhì)量控制方面的研究較多[16-22]。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特性，因此單一指標(biāo)性成分不能反映中藥質(zhì)量。2010版《中華人民共和國(guó)藥典》中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)將“從單指標(biāo)向多指標(biāo)、從指標(biāo)性成分向藥效成分控制”定為今后中藥質(zhì)量控制發(fā)展方向[23]。綜合考慮現(xiàn)有指導(dǎo)方針及階段中藥質(zhì)量控制模式，本研究對(duì)紅曲中7個(gè)核苷類成分進(jìn)行定量分析，為今后紅曲質(zhì)量控制提供了一定的參考依據(jù)及理論實(shí)踐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JA11002B電子分析天平（0.01～1100 g）（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、BSA224S（0.0001～220 g）和BT25S（0.00001～21 g）型分析天平（德國(guó)Sartorius公司）、智能超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent）、Avium 611VF超純水機(jī)（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 試藥

胞苷購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：150515）；肌苷、尿嘧啶、胸苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、腺苷購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)分別為：140669-201606，100469-201302、101215-201401、140661-200903、110886-201102、110879-201703）。

檢測(cè)過程中使用的試劑均為色譜純及超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用RP-HPLC法，色譜柱Shiseido C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀（B）二元線性梯度洗脫：0～9 min，0%A；9～40 min，0%～8%A；流速1 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量20 μL。采用超純水作為陰性對(duì)照溶液。見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取核苷類對(duì)照品適量，加超純水制備成尿嘧啶50 μg/mL、胞苷61.4 μg/mL、次黃嘌呤55.7 μg/mL、腺嘌呤468.7 μg/mL、肌苷114.3 μg/mL、胸苷52.9 μg/mL、腺苷111.4 μg/mL的溶液，備用。

2.3 供試品溶液制備

粉碎紅曲，過40目篩，稱取粉末3 g，精密稱定，加入具塞錐形瓶中，精密加入超純水30 mL，超聲提取20 min，過濾。錐形瓶及紅曲殘?jiān)眠m量超純水洗滌，過濾，合并濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，超純水定容至容量瓶刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取尿嘧啶1 mL、胞苷2 mL、次黃嘌呤2 mL、腺嘌呤1 mL、肌苷1 mL、胸苷1 mL和腺苷2 mL對(duì)照品溶液，制備成系列混合對(duì)照品溶液，其濃度范圍為尿嘧啶1.00～5.00 μg/mL、胞苷3.08～15.35 μg/mL、次黃嘌呤2.78～13.95 μg/mL、腺嘌呤9.37～46.87 μg/mL、肌苷4.58～22.86 μg/mL、胸苷1.06～5.29 μg/mL、腺苷4.41～22.28 μg/mL，精密吸取20 μL混合對(duì)照品溶液注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。結(jié)果顯示，對(duì)照品濃度在一定范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。見表1。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取20 μL混合對(duì)照品溶液，其濃度為尿嘧啶（5.00 μg/mL）、胞苷（15.35 μg/mL）、次黃嘌呤（13.95 μg/mL）、腺嘌呤（46.87 μg/mL）、肌苷（22.86 μg/mL）、胸苷（5.29 μg/mL）和腺苷（22.28 μg/mL），及同一供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)6次，記錄標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液、供試品中核苷色譜峰面積。尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷對(duì)照品溶液RSD為0.61%、1.47%、1.44%、0.51%、0.61%、0.77%、0.63%；供試品溶液RSD為1.46%、1.42%、1.24%、1.49%、1.08%、1.10%、1.52%。提示儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別于0、2、4、6、8、10 h精密吸取20 μL同一供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果。在10 h內(nèi)，供試品溶液中尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷峰面積RSD分別為1.73%、1.46%、1.16%、1.68%、1.11%、1.67%、0.89%。提示供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批次樣品6份，按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，并按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果。尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷含量RSD分別為1.33%、1.62%、1.55%、1.47%、1.87%、1.56%、1.45%，提示重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率

精密稱取1.5 g已知含量的紅曲樣品6份（批號(hào)：170205），加入一定量的核苷對(duì)照品，按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，并按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算含量及加樣回收率。加樣回收率結(jié)果見表2。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.9 紅曲中7種核苷類成分含量測(cè)定

取不同批次的紅曲樣品，按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備紅曲供試品溶液，并按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表3。

3 討論

本研究考察了Shiseido C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent TC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Thermo C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，其中Shiseido C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱的分離效果及峰型最優(yōu)?？疾炝肆鲃?dòng)相乙腈、甲醇及水、甲酸水、磷酸水的不同組合和比例，結(jié)果乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀作為流動(dòng)相組合的分離度及峰型最優(yōu)。本研究分別對(duì)超聲提取及回流提取進(jìn)行了考察，超聲提取法對(duì)紅曲樣品的所用提取時(shí)間最短，紅曲中提取出的核苷類含量高，因此本研究提取方法為超聲提取法。提取溶劑的選擇上，考察了不同體積比的甲醇-水系統(tǒng)，結(jié)果超純水作為提取溶媒時(shí)，核苷類化合物出峰多，且紅曲中所檢測(cè)的核苷含量高。

本研究紅曲中7種核苷（尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷）在一定濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系（r ≥ 0.9995），方法學(xué)考察提示該方法適用于紅曲中核苷類成分檢測(cè)。不同批次的紅曲中的核苷類成分并不穩(wěn)定，推測(cè)不同的原料來源及菌種來源對(duì)于紅曲中的核苷類成分含量具有一定影響。本研究對(duì)紅曲中7個(gè)核苷類成分進(jìn)行定量分析，為今后紅曲質(zhì)量分析提供了一定的參考依據(jù)及理論實(shí)踐。

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（收稿日期：2018-06-01 本文編輯：王 蕾）