霍夢(mèng)露，王瑞瑤，李超，關(guān)錫梅，倪偉建，唐麗琴

[1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230031;2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)藥劑科]

糖尿病心肌病(DCM)糖尿病心肌病不加干預(yù)最終可發(fā)展成為心力衰竭、心律失常及心源性休克，是造成糖尿病患者高致死和致殘率的重要因素之一，因此積極的預(yù)防和治療糖尿病心肌病對(duì)糖尿病患者有著迫切的現(xiàn)實(shí)意義[1]。黃連是我國(guó)的常用中藥，古時(shí)常用于痢疾等胃腸道感染和消渴癥即糖尿病的治療。小檗堿(BBR)作為黃連的主要有效成分，已被現(xiàn)代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察證實(shí)可以降低血糖、降低血脂、改善胰島素抵抗，對(duì)2型糖尿病有積極的治療作用[2-3]，在糖尿病心肌病方面，課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)表明小檗堿可以降低糖尿病心肌病大鼠的血糖和血脂。本實(shí)驗(yàn)將在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過檢測(cè)糖尿病心肌病大鼠心肌酶以及使用超聲心動(dòng)圖法比較大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化，進(jìn)一步觀察小檗堿對(duì)糖尿病心肌病大鼠心臟的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及飼喂 清潔級(jí)雄性SD大鼠由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk (皖)2017-001，飼喂于中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物房，喂養(yǎng)時(shí)保持環(huán)境安靜，溫度控制在20～25 ℃，相對(duì)濕度控制在40%～70%，保持通風(fēng)良好。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2018年4月至10月。

1.2 試劑 高糖高脂飼料(20%蔗糖，10%豬油，6%蛋黃粉，0.5%膽鹽，63.5%基礎(chǔ)飼料[4])，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich 公司；BBR由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；鹽酸二甲雙胍片(中美施貴寶公司生產(chǎn))；鹽酸曲美他嗪片(天津施維雅公司生產(chǎn))。

1.3 主要儀器 ME204E電子分析天平，Mettler Toledo 公司；ACS-DⅡ計(jì)重秤，上海乾峰電子儀器有限公司；SC-3610離心機(jī)，安徽中科中佳儀器有限公司；DMI3000B熒光倒置顯微鏡,德國(guó)萊卡；小動(dòng)物超聲裝置vevo2100，加拿大Visual sonic公司；血糖檢測(cè)系統(tǒng)，湖南三諾生物傳感公司；日立全自動(dòng)生化分析儀7600型，日立公司。

1.4 方法

1.4.1 模型的建立及指標(biāo)檢測(cè) 雄性SD大鼠36只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為健康對(duì)照組(NC，n=6)和高糖高脂組(n=30)。

對(duì)照組大鼠以普通飼料喂養(yǎng)，高糖高脂組大鼠則喂以高糖高脂飼料，6周后，高糖高脂組的大鼠腹腔注射給藥STZ 30 mg/kg，(STZ溶液溶劑為pH 4.2～4.5枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液，避光，現(xiàn)配現(xiàn)用)，對(duì)照組注射等劑量的緩沖鹽溶液，3 d后和7 d后，禁食12h檢測(cè)大鼠的空腹血糖(FBG)，以連續(xù)2次血糖≥11.1 mmol/L視為糖尿病模型成功[5-6]，未成模大鼠再適量補(bǔ)充注射STZ，繼續(xù)高糖高脂飲食喂養(yǎng)12周成糖尿病心肌病模型。

模型大鼠隨機(jī)分為糖尿病心肌病模型組(DCM組，6只)，二甲雙胍組(二甲雙胍 200 mg/kg，6只)，曲美他嗪組(曲美他嗪 10 mg/kg，6只)，小檗堿低劑量組(BBR 100 mg/kg，6只)，小檗堿高劑量組(BBR 200 mg/kg，6只)。實(shí)際使用共30只模型大鼠及6只未建模對(duì)照鼠。

本實(shí)驗(yàn)采用預(yù)防性給藥，即造成糖尿病模型開始給藥，持續(xù)12周。藥物均使用0.5%羧甲基纖維素鈉作為溶媒，每組按所示藥物種類和劑量進(jìn)行灌胃，DCM組和NC組均以相同給藥途徑給予等量的溶媒，灌胃期間健康對(duì)照組以普通飼料喂養(yǎng)，其余各組繼續(xù)喂高糖高脂飼料。

1.4.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心臟功能 灌胃給藥12周結(jié)束，對(duì)大鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。將大鼠左胸前區(qū)域進(jìn)行脫毛后，持續(xù)性用異氟烷(已使用霧化罐將其轉(zhuǎn)化為可吸入性氣體)麻醉，仰位固定于檢查臺(tái)上，臺(tái)溫設(shè)定為37℃[7]，使用超聲探頭尋找大鼠心臟胸骨旁左室長(zhǎng)軸切面，左室短軸切面以及四腔心切面，分別保存長(zhǎng)軸切面的B-MODE模式，短軸切面的M-MODE和四腔心切面的彩色多普勒模式下的動(dòng)態(tài)圖像，所得圖像可使用儀器的所安裝的vevo 2100系統(tǒng)分析獲得大鼠的左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，短軸收縮率(FS),E/A比值指標(biāo)[8-10]。

1.4.3 大鼠血糖血脂和心肌酶的檢測(cè) 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)完畢后，大鼠禁食12 h，腹主動(dòng)脈取血，3700 r/min,10 min，收集上層血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中的肌酸激酶(CK),乳酸脫氫酶(LDH)，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)[11-12],三酰甘油(TG)，膽固醇(TC)以及空腹血糖FBG的含量[13]。

1.4.4 計(jì)算心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比(HW/BW) 大鼠處死前稱重，記錄下體質(zhì)量(BW)，腹主動(dòng)脈采血后，取下心臟使用冷的PBS清洗殘余血液，剪去多余的結(jié)締組織，天平稱心臟質(zhì)量(HW)。計(jì)算HW/BW。

1.4.5 心臟組織的病理學(xué)檢測(cè) 沿心臟左心室橫切，將橫切面至心臟基底方向組織置于10倍體積的4%多聚甲醛中固定48 h后，石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE染色和Masson染色，顯微鏡觀察心肌組織切片病理變化[14]。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)期間，NC組大鼠皮毛光潔，尾巴完整并呈現(xiàn)出健康粉紅色，精神狀況較好，DCM組大鼠毛發(fā)較臟，發(fā)暗發(fā)灰，爛尾，尿液中有糖類結(jié)晶析出，行動(dòng)遲緩，有部分大鼠眼睛出現(xiàn)白色陰翳，BBR組和TMZ組相較于DCM組大鼠，毛色和精神狀態(tài)有明顯好轉(zhuǎn)。

2.2 HW/BW 相較于NC組，DCM組大鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比顯著升高(P<0.05)，提示DCM組已經(jīng)發(fā)生了心臟的肥大病變；二甲雙胍組HW/BW相較于DCM組，比值有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),BBR高劑量組和TMZ組心臟質(zhì)量占比與DCM組相比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示BBR和TMZ對(duì)大鼠的心肌肥厚有抑制作用。見表1。

表1 小檗堿對(duì)糖尿病心肌病大鼠心臟質(zhì)量/體質(zhì)量的影響

注：與健康對(duì)照組比較，aP<0.05;與糖尿病心肌病模型組比較，bP<0.05

2.3 大鼠血糖血脂和心肌酶的檢測(cè)結(jié)果 DCM組大鼠的FBG、TG、TC含量顯著高于NC組(P<0.05)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的糖尿病心肌病大鼠的特征相符，CK、LDH、AST值也呈現(xiàn)相同趨勢(shì)(P<0.05)；二甲雙胍可明顯降低大鼠血清中FBG、TC、AST(P<0.05)的含量而對(duì)其余指標(biāo)無(wú)明顯影響。TMZ無(wú)法緩解糖尿病引起的高血糖(P>0.05)，高膽固醇(P>0.05)和高三酰甘油(P>0.05)癥狀，但可以減少心肌酶CK、LDH和AST(P<0.05)釋放入血的量；BBR高劑量組給藥12周后，與DCM組相比，高劑量組空腹血糖、三酰甘油、膽固醇、肌酸激酶、乳酸脫氫酶(P<0.05)都明顯降低，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的含量也有所下降(P<0.05)，低劑量組給藥組各指標(biāo)水平也均下降，但僅TC、CK、LDH(P<0.05) 的水平與DCM組有差異，提示BBR對(duì)糖尿病心肌病的大鼠具有保護(hù)作用且呈一定的劑量相關(guān)性。見表2。

2.4 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心臟的功能結(jié)果 臨床上常用來(lái)評(píng)價(jià)心臟收縮功能的主要有兩個(gè)指標(biāo)：左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和短軸縮短率(FS),LVEF是指每搏輸出量占心室舒張末期容積量的百分比，F(xiàn)S是指左心室舒張末期內(nèi)徑與收縮期內(nèi)徑之差占左心室舒張末期內(nèi)徑的百分比。E/A比值是心臟左心室舒張功能的標(biāo)志。它表示舒張前期重力引起的從心房到心室血流的峰值流速(E波)與后期心房收縮引起的峰值流速(A波)之比。根據(jù)心臟短軸切面獲得M-mode圖像分析統(tǒng)計(jì)EF和FS值，四腔心切面的彩色多普勒?qǐng)D像分析E/A值，具體結(jié)果如下圖3，與NC組相比，DCM組大鼠的LVEF，F(xiàn)S，E/A比值(P<0.05)下降,提示糖尿病心肌病模型組大鼠心肌已經(jīng)出現(xiàn)了收縮和舒張功能的損傷；二甲雙胍組的LVEF，F(xiàn)S，E/A有輕微的提升，但與DCM組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TMZ提高心臟功能的作用較為顯著，LVEF，F(xiàn)S和E/A(P<0.05)值與DCM組比較上升明顯；BBR低劑量組可提高EF值(P<0.05),而高劑量組可以改善心臟的LVEF，F(xiàn)S，E/A(P<0.05)，提高心臟的收縮的舒張功能。見表3。

2.5 HE染色和Masson染色結(jié)果 HE染色中心肌纖維紅染，細(xì)胞核藍(lán)染，從圖1可看出NC組鼠心肌纖維形態(tài)均勻，排列規(guī)律緊密，細(xì)胞核藍(lán)染清晰可見；DCM組心肌排列疏松紊亂，肌纖維肥大斷裂，有空泡樣變性，細(xì)胞核深染；二甲雙胍組，TMZ組和BBR組經(jīng)藥物治療后，心肌損傷情況有不同程度的改善，心肌排列較DCM組規(guī)則且細(xì)胞核清晰可見。

Masson染色可直觀顯示出心肌組織內(nèi)膠原沉積情況，肌纖維經(jīng)著色后成紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。NC組大鼠心臟膠原組織分布均勻，含量適宜，血管周圍纖維化程度較輕；DCM組大鼠可見藍(lán)染部分即膠原組織明顯增多，相互連接成網(wǎng)狀，排列紊亂，分布不均，血管周圍纖維組織明顯增多；各給藥組心肌纖維化情況均有所改善，以TMZ組效果最佳，BBR高劑量和低劑量組也顯示出了抗纖維化的作用。見圖2。

表2 小檗堿對(duì)大鼠血清血脂和心肌酶指標(biāo)的影響

注：FBG為空腹血糖，TG為三酰甘油，TC為膽固醇，CK為肌酸激酶，AST為天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，LDH為乳酸脫氫酶；與健康對(duì)照組比較，aP<0.05;與糖尿病心肌病模型組比較，bP<0.05

表3 小檗堿對(duì)糖尿病心肌病大鼠心臟功能的影響

注：與健康對(duì)照組比較，aP<0.05;與糖尿病心肌病模型組比較，bP<0.05

圖1小檗堿對(duì)心肌組織的影響(HE染色，200×)。A：健康對(duì)照組，B：糖尿病心肌病模型組(紅色箭頭處肌纖維斷裂，黑色箭頭處細(xì)胞核呈空泡樣改變)，C：二甲雙胍組，D：曲美他嗪組，E：小檗堿低劑量組(100 mg/kg)，F(xiàn)：小檗堿高劑量組(200 mg/kg)

圖2小檗堿對(duì)心肌組織纖維化的影響(Masson染色，200×)。A：健康對(duì)照組，B：糖尿病心肌病模型組(黑色箭頭所指示為血管，紅色箭頭所指示為膠原纖維)，C：二甲雙胍組，D：曲美他嗪組，E：小檗堿低劑量組(100 mg/kg)，F(xiàn)：小檗堿高劑量組(200 mg/kg)

3 討論

糖尿病心肌病是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，現(xiàn)糖尿病心肌病的動(dòng)物造模多采用先高糖高脂飼料加上小劑量的注射STZ建立糖尿病模型[15]，再繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)6～16周時(shí)間以誘導(dǎo)出糖尿病心肌病，目前糖尿病心肌病模型的驗(yàn)證尚無(wú)統(tǒng)一定論，主要集中在血糖血脂水平的檢測(cè)，大鼠心臟功能的評(píng)價(jià)以及病理切片染色觀察等方面，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合了急性心肌梗死死心肌細(xì)胞釋放入血的心肌酶譜，在常規(guī)的血糖血脂指標(biāo)檢測(cè)的基礎(chǔ)上考察了CK、LDH、AST的含量，并使用無(wú)創(chuàng)的超聲心動(dòng)圖進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)糖尿病心肌病模型建立的成功與否以及小檗堿對(duì)糖尿病心肌病大鼠的保護(hù)作用。

CK、LDH、AST是心肌細(xì)胞胞內(nèi)酶，亦是屬于心肌酶譜的酶類，在正常狀態(tài)時(shí)催化細(xì)胞的代謝活動(dòng)，當(dāng)心肌細(xì)胞受到損傷發(fā)生壞死時(shí)，可破裂釋放入血，血液中含量增加，因此，臨床上一般用心肌酶的水平來(lái)間接衡量心肌細(xì)胞的損害程度。非侵入式超聲心動(dòng)圖作為臨床上檢測(cè)心臟功能的常用手段，受限于儀器昂貴的成本，近些年才在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中普及開，其相較于之前常采用的左心室插管測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的方法，具有無(wú)創(chuàng)性、直觀性、節(jié)約樣本量的優(yōu)點(diǎn)。本研究從超聲心動(dòng)圖所獲得的心臟信息中選取較為常用的收縮功能指標(biāo)(EF和FS)，舒張指標(biāo)(E/A)，通過數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析的方法比對(duì)模型組與對(duì)照組的，給藥組和模型組的數(shù)據(jù)得出造模和藥物干預(yù)得結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂飲食喂養(yǎng)6周后小劑量注射STZ并繼續(xù)高糖高脂喂養(yǎng)12周成功復(fù)制出糖尿病心肌病的大鼠模型。小檗堿給藥12周后可降低大鼠的血糖、血膽固醇和三酰甘油、心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比，其中高劑量干預(yù)組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與本課題前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。小檗堿高劑量組也能顯著性地降低血清中CK、LDH、AST的含量，顯示出了對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，糖尿病心肌病大鼠的收縮和舒張功能經(jīng)過灌胃給藥小檗堿后，也有顯著性提高，HE和Masson特異性染色可看出小檗堿給藥組心肌纖維化降低，肌纖維排列緊密，有序化程度升高，細(xì)胞核均勻分布，染色深淺適宜。因此可得出結(jié)論，小檗堿對(duì)糖尿病心肌病大鼠的心肌和心臟功能具有一定的保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)AMPK相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。