張一思，劉秀麗，潘潔，劉思涵，王文聞

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤一科，哈爾濱 150001)

X線放射治療是臨床治療惡性腫瘤的常見手段。射線除了對腫瘤細胞具有殺傷作用，還可能對正常組織有損傷，其中較嚴重的放射性損傷為炎性損傷和纖維化損傷。過氧化物酶體增殖因子活化受體γ(PPAR-γ)可以調節(jié)糖脂類的代謝及血管的炎性增殖等關鍵蛋白的基因表達，對非放療導致的炎性反應及間質纖維化有抑制作用。但PPAR-γ對放療導致的纖維化損傷及炎性損傷方面尚無太多報道?；|金屬蛋白酶-9(MMP-9)高表達可導致膠原系統(tǒng)破壞及變性膠原纖維增多。TIMPs家族中的組織金屬蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)是組織中MMPs的特異性抑制物之一。TIMPs與MMPs在體內的平衡是保障組織細胞的增殖、凋亡及細胞外基質穩(wěn)態(tài)的重要條件。本文擬觀察正常小鼠L929細胞受到X線照射后分泌的MMP-9和TIMP-1表達的變化，及加入PPAR-γ配體吡格列酮活化L929細胞后對以上因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞獲取及種植 L929細胞購自上海細胞庫(批號：170622)。使用復蘇后第3～10代細胞，細胞密度為2×104/mL。按每孔200 μL接種于96孔板中。每組設5個重復孔。將胰酶加入10 %胎牛血清+1 %青鏈霉素+RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute,洛斯維·帕克紀念研究所)培養(yǎng)液，消化3 min，放入離心機(離心半徑15 cm,轉速1000 r/min)離心5 min，棄上清，加培養(yǎng)液吹打成細胞懸液，移至培養(yǎng)瓶，放入5 % CO2、37 ℃的CO2孵箱。采用RT-PCR法證實L929細胞中是否存在PPAR-γ表達。

1.2 細胞照射及藥物處理 采用X線(劑量率450 cGy/min，10 Gy)于室溫下對L929細胞分別照射。L929細胞生長至90 %融合狀態(tài)時更換0.1 %胎牛血清培養(yǎng)基孵育24 h，使細胞不處于增殖狀態(tài)，用RT-PCR方法觀察照射前與照射后0 h、2 h、7 h、24 h和48 h時 L929細胞中的MMP-9，TIMP-1的表達情況。再給予上述L929細胞以吡格列酮(北京太洋藥業(yè)股份有限公司，批號:161008)，30 μmol/L處理10 h后照射，照射結束后不更換培養(yǎng)基，將細胞送回CO2孵箱，按實驗設計時間收取樣品。用RT-PCR方法觀察照射48 h時L929細胞中的MMP-9，TIMP-1表達。用二甲基亞砜(DMSO)溶解PPAR-γ配體，DMSO終濃度<1‰。

1.3 細胞總RNA提取 處理后的L929細胞去除培養(yǎng)基，PBS沖洗2次置于直徑10 cm培養(yǎng)皿中，加入1 mL Trizol在室溫下輕搖培養(yǎng)皿5 min；再移至離心管中加入200 μL氯仿震動15 s，室溫下放置3 min后離心(離心半徑15 cm,轉速12 000 r/min，4℃)15 min。吸出上層水相移至離心管，再加入0.5 mL異丙醇，充分混勻后于室溫下擱置10 min再離心(離心半徑15 cm,轉速12 000 r/min，4 ℃)10 min，棄上清；RNA沉于管底，用1 mL 75 %乙醇輕輕沖洗后再離心(離心半徑15 cm,轉速8 000 r/min，4 ℃)5 min，棄上清；再加入DMSO的0.9%氯化鈉注射溶液溶解RNA，采用酶標儀A260、A280檢測RNA的純度和濃度。樣本用后至于-80 ℃冰箱長期保存。

1.4 RT-PCR方法 取500 μg的RNA樣品反轉錄成cDNA(complementary DNA，互補DNA)，按逆轉錄試劑盒(TaKaRa:DRR037A)說明書進行規(guī)范化操作，于總反應體積10 μL中加入反轉錄酶和引物，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，得到cDNA。PCR擴增：用擴增試劑盒(TaKaRa:DRR003A)中PremixTaq 12.5 mL得到的cDNA 2 μL，上下游引物(20 μM)各0.5 μL，補足滅菌蒸餾水至25 μL。引物序列分別為:PPAR-γ順式5′-TTTTCAAGGGTGCCAGTTC-3′，反式5′AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3′，擴增片斷長198 bp。MMP-9順式5′-TTCACCGGCTAAACCACCTC-3′反式5′-CATGCATGTGAACATAACCTCA-3′擴增片斷長73 bp。TIMP-1順式5′-ACAGACAGCCTTCTGCAACTCPC-3′，反式5′-ACTGCGGTTCTGGGACTTG-3′，擴增片斷長217 bp。GAPDH順式5′-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′，反式5′GGACACATTGGGGGTAGGAACA-3′，擴增片斷長225 bp。反應條件為95 ℃，5 s一個循環(huán)，95 ℃，5 s；55 ℃，30 s；70 ℃，30 s，30個循環(huán)。用3%的瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物。用凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)分析結果。內參照為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。

1.5 統(tǒng)計學處理 用SPSS 11.5軟件對不同時點MMP-9、TIMP-1的電泳結果數(shù)據(jù)進行方差分析，結果有差異后采用LSD法進行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PPAR-γ表達 RT-PCR的電泳結果顯示，L929細胞中存在PPAR-γ的表達，如圖1所示。

圖1 L929細胞表達PPAR-γ的電泳圖

2.2 單純照射的RT-PCR結果 經(jīng)X線照射不同時間L929細胞中MMP-9的電泳結果顯示，未經(jīng)照射(0 h)的L929細胞和經(jīng)X線照射的L929細胞胞核中都有MMP-9的表達，照射后0 h、2 h、7 h、24 h、48 h每一時間點與照射前的MMP-9表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義，P均<0.05；照射后0 h、2 h、7 h、24 h每一時間點與其后各時間點的MMP-9表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義，P均<0.05，而且隨照射后時間的延長其表達逐漸增加，在10 Gy照射后48 h表達最高(F=4.135，P=0.022)，見圖2。X線照射時間對TIMP-1表達的影響規(guī)律與MMP-9相反，隨照射后時間的延長TIMP-1表達逐漸減少，照射后0 h、2 h、7 h、24 h、48 h每一時間點與照射前的TIMP-1表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義，P均<0.05；照射后0 h、2 h、7 h、24 h每一時間點與其后各時間點的TIMP-1表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義，P均<0.05，在10 Gy照射后48 h TIMP-1表達最低(F=3.646，P=0.041)，見表1和圖3。

表1 不同時點L929細胞中MMP-9、TIMP-1表達的比較

注：MMP-9為基質金屬蛋白酶-9，TIMP-1為基質金屬蛋白酶抑制物-1，下表、圖同；與其照射后各時間點同指標的比較，aP<0.05；與其后各時間點同指標的比較，bP<0.05

注：GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，下圖同

圖2不同劑量X線照射不同時間后L929細胞MMP-9 表達的典型電泳結果

圖3 不同劑量X線照射不同時間后L929細胞TIMP-1表達的典型電泳結果

2.3 加入吡格列酮后RT-PCR結果 照后48 h 用RT-PCR檢測結果顯示，吡格列酮降低了10 Gy照射誘導的MMP-9過度表達[0.76∶0.52 (F=3.735,P=0.024)]。吡格列酮升高了10 Gy照射誘導的TIMP-1過度抑制[0.17∶0.27 (F=3.908,P=0.032)]。見圖4,5。

注：Pio為吡格列酮；DMSO為二甲基亞砜

圖4X線照射后48 h不同處理條件下L929細胞MMP-9表達的典型電泳結果

圖5 不同處理條件下L929細胞TINMP-1表達的典型電泳結果

3 討論

腫瘤放療過程中組織出現(xiàn)的放射損傷在病理學上表現(xiàn)為慢性炎癥和修復共同作用的結果。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，MMPs與慢性炎性滲出和纖維化關系密切[1-4]。MMPs中MMP-9在多種細胞內具有表達，作用底物廣泛。TIMP-1主要來源于L929細胞、各種腫瘤細胞、單核細胞等，其主要功能為調節(jié)細胞粘著，參與細胞外基質的降解與重建。TIMP-1是降解Ⅳ型膠原的主要酶，后者是細胞基膜的主要成分，其損傷可導致細胞膜結構異常通透性增高和炎性介質滲出，最終導致細胞外基質沉積纖維化形成。MMP-9在體內的表達受多種因子的調控，包括特異性及非特異性調控因子。其中TIMP-1即為MMP-9的特異性抑制劑[5-6]。

肺纖維化(PF)的發(fā)病機制目前尚未完全明確[7]。目前認為，PF為肺間質性疾病。其病理特點為長期的彌漫性肺泡炎癥和胞外基質的過度沉積。對PF的治療尚缺乏有效、且副作用低的藥物。近年來PPAR-γ在PF中的作用受到學者們越來越多的關注。PPAR-γ屬于有配體激活的Ⅱ核受體超家族，其作用廣泛，除了參與脂質代謝和體內糖平衡外，還參與多種疾病的炎癥和纖維化過程。PPAR-γ具有抗炎抗纖維化作用[8-10]。

關于PPAR-γ在非放射性導致的炎癥和纖維化過程中的作用，現(xiàn)已有不少的報道。已有的研究顯示，PPAR-γ配體可抑制MMP-9的表達，促進TIMP-1的表達。Liu等[11]實驗中采用大鼠肝纖維化模型來考察羥基紅花黃色素A(HSYA)抗肝纖維化的作用機制。其實驗結果顯示，PPAR-γ信號轉導是肝纖維化病程中的關鍵通路，其在H SYA抑制肝纖維化作用機制中系通過促進PPARγ表達、上調TIMP-1蛋白表達而起到預防肝纖維化的作用。周瑾等[12]實驗中考察腎間質L929細胞(NRK-49F)發(fā)生表型轉化時的MMP-9及其抑制因子TIMP-1表達的變化。其結果表明，TIMP-1基因蛋白表達水平的上調可減少細胞外基質的降解，從而誘導腎間質L929細胞的活化。周曉霞等[13]研究中應用PPARγ激動劑-曲格列酮或GW9662-PPARγ拮抗劑分別對宮頸癌HeLa細胞進行干預。其結果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較,在干預后的不同時點(0、24 h、48 h和72 h)，激動劑組HeLa細胞的活性隨時間依賴性降低。其中干預48 h后激動劑組的ICAM-1和MMP-9和蛋白表達均明顯降低，而其HeLa細胞PPARγ和蛋白表達和PPARγ 核轉位水平均顯著增加。該研究結果表明，促進PPARγ表達和PPARγ核轉錄水平可下調HeLa 細胞ICAM-1和MMP-9的合成,抑制HeLa細胞的增殖。尹鵬等[14]研究中探討替米沙坦對PPAR-γ及結腸癌SW480細胞TIMP-1表達水平的影響。其結果發(fā)現(xiàn)，替米沙坦干預后在不同時點(0、24 h和72 h) SW480細胞活性逐漸降低，而TIMP-1、PPAR-γ和蛋白的表達呈時間依賴性遞增。該結果表明，上調PPAR-γ表達可促進結腸癌細胞TIMP-1的合成和分泌,而導致SW480細胞生長和侵襲能力的降低。王闖[15]研究中探討了肝細胞癌PPARγ/PTEN/MMP-9信號通路的存在及其MMP-9表達水平。其結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PPARγ配體即15-脫氧-前列腺素J2(15-d-PGJ2)處理后，對肝癌細胞增殖有劑量依賴性的抑制作用，且上調PTEN和蛋白的表達，減少MMP-9和蛋白的表達；而PPARγ抑制劑GW9662可扭轉這一作用。該結果表明，通過PPARγ/PTEN/MMP-9信號通路下調MMP-9表達可抑制肝癌細胞的侵襲和轉移。還有其他學者的研究結果表明，PPAR-γ配體能抑制MMP-9的表達，促進TIMP-1的表達。李春陵等[16]研究中考察丹參酮ⅡA 磺酸鈉對慢性阻塞性肺疾病(COPD)氣道重塑大鼠PPARγ和核因子-κB 表達的作用。其結果顯示，經(jīng)丹參酮ⅡA 磺酸鈉干預后大鼠血清MMP-9等含量明顯降低，而TIMP-1、TIMP-2表達明顯升高。該結果表明，調節(jié) PPARγ表達可抑制MMP-9、TIMP-1、TIMP-2等因子的表達水平。Chuang等[17]考察槲皮素代謝產(chǎn)物qP對細胞侵襲和遷移的作用。其結果可見，qP以劑量依賴的方式可抑制MMPs表達和細胞的侵襲和遷移，而PPAR-γ拮抗劑GW9662可對抗這一作用。該結果表明，對PPARγ的上調作用于MMP-9、TIMP-1、TIMP-2等因子從而抑制了細胞的侵襲和遷移。鄒娜等[18]研究中對子癇前期患者胎盤組織中的MMP-2、TIMP-2、PPARγ表達及臨床意義進行考察。其結果可見，MMP-2的表達水平從正常足月妊娠、到輕度子癇前期、再到重度子癇前期呈下降趨勢，而TIMP-2、PPARγ表達水平有升高趨勢。其相關性分析結果顯示，MMP-2與TIMP-2和PPARγ表達呈負相關。該結果表明，子癇前期患者胎盤組織中可見MMP-2表達的下調，而TIMP-2和PPARγ的表達為上調，可見MMP-2、TIMP-2、PPARγ的表達是負相關的。

如上已有的研究結果均提示，MMP-9、TIMP-1表達水平的變化與非放療所致的炎性反應、間質纖維化的進程等有關，而PPAR-γ能夠調節(jié)炎性增殖相關的關鍵蛋白的基因表達、從而起到抑制炎癥和組織纖維化的作用。但目前PPAR-γ在放射導致的炎癥和纖維化過程中的作用還少有報道。

本研究中通過添加PPAR-γ配體吡格列酮使其活化后作用于被X線照射后的L929細胞，旨在觀察L929細胞分泌MMP-9，TIMP-1表達的變化情況。本研究結果發(fā)現(xiàn)，X射線照射L929細胞后出現(xiàn)纖維化相關因子MMP-9表達升高，TIMP-1表達降低。筆者分析，L929細胞受X線照射48 h后出現(xiàn)了早期炎性反應，故MMP-9表達增高，TIMP-1表達降低。

熊園園[19]考察了2型糖尿病患者血清中TIMP-2、hs-CRP及腎臟NF-κB表達的相關性。其結果發(fā)現(xiàn)，治療后NF-κB在吡格列酮組大鼠腎組織中的表達多呈弱陽性，較糖尿病模型組大鼠的表達降低，表明吡格列酮能抑制TIMP-2、NF-κB、hs-CRP等炎性因子的表達，降低血糖,調節(jié)機體免疫平衡。劉春麗等[20]考察了吡格列酮對高脂血癥大鼠MMP-2、MMP-9表達的作用。其結果可見吡格列酮組大鼠MMP-2、MMP-9表達水平均顯著下降，表明吡格列酮可抑制MMP-2、MMP-9表達。在本研究中發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可使MMP-9高表達降低，使TIMP-1低表達升高，本研究結果表明吡格列酮可以抑制MMP-9表達、促進TIMP-1表達。

徐龍[21]研究中對放療所致放射性肺纖維化的發(fā)生規(guī)律與其分子機制進行了考察。其實驗中建立了雌性C57BL/6小鼠放射性肺纖維化模型，分別于照射后1、3、6個月觀察小鼠肺組織中MMP-9及其抑制劑TIMP-1的表達。其結果可見，照射后小鼠肺組織的MMP-9、TIMP-1表達均顯著性增加,隨時間延長MMP-9增加更明顯。其結果表明，調節(jié)肺組織內MMP-9/TIMP-1比例可減輕小鼠放射性肺纖維化的病變程度。在本研究中，將添加PPAR-γ配體的吡格列酮活化后作用于被X線照射后的L929細胞，本研究得到的結果證實TIMP-1為MMP-9的特異性抑制劑、兩者在體內表達水平的相反升降趨勢，本研究結果也表明PPAR-γ配體吡格列酮對成纖維細胞分泌MMP-9，TIMP-1表達的調節(jié)作用。本研究得出的結果與如上已有的文獻對于PPAR-γ、MMP-9及TIMP-1的報道均有一定程度的吻合。

綜上所述，X線照射初期使L929細胞分泌MMP-9增多，TIMP-1減少，可能促使炎性因子的急性期滲出，最終促進細胞外基質沉積導致纖維化的形成，而PPAR-γ配體吡格列酮可以抑制這種表達，最終可能抑制X線導致的放射性纖維化的損傷反應。