喻 標，楊慶華，任建文，陳少秀，景海霞，段德鑒

毛囊角化病又稱Darier病（Darier"s disease，DD），是一種少見的以表皮細胞角化不良為基本組織病理變化的慢性角化性皮膚病，呈常染色體顯性遺傳。臨床表現(xiàn)為皮脂溢出部位多發(fā)的、小的紅褐色丘疹，伴有瘙癢和疼痛，其他的皮膚表現(xiàn)還有掌跖角化性凹點以及甲萎縮[1]。其分子基礎已被證實為編碼肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵ATP酶2的基因ATP2A2發(fā)生突變[2]。本研究收集了一個DD家系，應用直接測序的方法對其ATP2A2基因突變進行檢測。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

該家系共4代18人，6人患?。▓D1）。先證者男，12歲，6年前頸部出現(xiàn)淡褐色丘疹，自覺瘙癢，皮損逐漸增多，累及面部、腋窩、腹部（圖2a）。其母皮損泛發(fā)，面頸部、腹部、雙側(cè)腋窩、腹股溝以及手足背廣泛受累，呈對稱密集多發(fā)的褐色堅實丘疹，部分皮損融合成斑塊，日曬或出汗加重，同時伴有指（趾）甲受累（圖2b）。其舅臨床表現(xiàn)與其母類似，皮損以面頸部及胸背部為甚。先證者、其母及其舅各系統(tǒng)檢查均未見異常。組織病理檢查示表皮角化過度，棘層肥厚，乳頭瘤樣增生，基底層上裂隙形成，可見棘層松解細胞，真皮慢性炎性細胞浸潤（圖3）。診斷：毛囊角化病。

圖1 毛囊角化病患者家系圖

1.2.1 外周血基因組DNA提取 征得患者同意后，采集所有患者及家系中正常人外周血各5.0 ml，同時采集100例無親緣關系的正常個體外周血各5.0 ml，并提取基因組DNA作為對照，以排除基因多態(tài)性。血樣均經(jīng)2%EDTA抗凝，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。

1.2.2ATP2A2基因全部外顯子的PCR擴增 按照參考文獻[3]設計特異性引物18對，擴增包括21個外顯子及其與內(nèi)含子交界區(qū)的序列。其中外顯子18引物序列：上游5"-GGGTTGGAGCCTGGACTTG-3"，下游5"-TTTTGGGAAGGGAAGAACTGT-3"。擴增條件：18號外顯子，95 ℃變性30 s，57 ℃復性30 s，72 ℃延伸 1 min，共35個循環(huán)，總反應體系50 μl。1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。

1.2.3 直接測序 PCR產(chǎn)物純化送上海桑尼公司，經(jīng)ABI377型DNA測序儀使用染料終止劑化學方法進行測序。測序結(jié)果采用Chromas軟件（版本2.0）對基因序列進行對比分析，確定突變位點。

圖2 毛囊角化病患者腹部（先證者）、雙手(母親)皮損

圖3 毛囊角化病先證者頸部皮損組織病理（HE染色）

圖4 先證者和正常對照者ATP2A2基因第18外顯子PCR擴增部分序列圖

2 結(jié)果

通過PCR產(chǎn)物直接測序，在患者ATP2A2基因第18外顯子中發(fā)現(xiàn)一個錯義突變，即在2728核苷酸處堿基A變成G（c.2728 A→G），導致先證者在910位（p.910 N→D）將天冬酰胺（AAC）替換為天冬氨酸（GAC）。先證者的母親和舅舅均發(fā)現(xiàn)存在同樣的突變，家系中其他未發(fā)病成員及正常對照100例經(jīng)測序未發(fā)現(xiàn)有此突變（圖4）。

3 討論

DD是一種少見的常染色體顯性遺傳性皮膚病。典型的DD皮損為油膩性，棕褐色密集的毛囊小丘疹，表面覆蓋痂皮，去除痂皮后丘疹頂端暴露漏斗狀小凹，丘疹增大可趨向融合，形成不規(guī)則疣狀斑塊，伴有瘙癢和疼痛，其他皮膚表現(xiàn)有掌跖角化性凹點及甲病變。臨床上應注意與融合性網(wǎng)狀乳頭瘤病、黑棘皮病、脂溢性角化、暫時性棘層松解性皮病及疣狀角化不良瘤等鑒別；在組織病理上需與慢性家族性良性天皰瘡鑒別[4]。

DD致病基因為ATP2A2，定位于12q23-q24.1，編碼肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子-ATP酶2（SERCA2）[5,6]。該基因長度約為76 kb，由21個外顯子組成，經(jīng)選擇性剪切其產(chǎn)物形成3種亞型：SERCA2a、SERCA2b和SERCA2c，分別由997、1 042、999個氨基酸組成。3種SERCA2同工酶蛋白質(zhì)序列前993個氨基酸相同，而羧基端存在差異，SERCA2b有一個延伸的羧基末端[6,7]。3種亞型的分布具有組織特異性，SERCA2a主要表達于心肌和慢速收縮骨骼肌；SERCA2b、SERCA2c則廣泛存在[7]，其中，SERCA2b主要表達于平滑肌和非肌肉組織中，包括角質(zhì)形成細胞[5,8]。人類表皮中發(fā)現(xiàn)的主要亞型即SERCA2b，該型在表皮生物學中起關鍵作用，其突變影響了蛋白的表達、降解和活性，進而影響了表皮間黏附分子的表達和角質(zhì)形成細胞的正常角化，致使出現(xiàn)棘細胞間的松解，最終導致Darier病[9]。

自從1999年首次報告ATP2A2基因突變以來，在353個家系或散發(fā)的DD患者中，共發(fā)現(xiàn)了253種獨特的突變，其中包括118個錯義突變和22個無義突變、21個重復、9個插入、51個缺失、27個剪接位點和3個插入/缺失突變[10]。但是，ATP2A2基因沒有所謂的突變熱點，這些突變位點分散在整個ATP2A2基因中[10,11]。相對而言，在ATP2A2基因兩個最大的外顯子8和14中發(fā)現(xiàn)了更多的突變[10]。大多數(shù)突變是單個家族所特有的，沒有證據(jù)表明基因型和表型之間的關系[11]。然而Sakuntabhai等[3]報道指出，嚴重的疾病表型主要見于錯義突變或框內(nèi)缺失突變的患者，而不是無義突變或移碼突變。Akagi等[12]則認為糜爛性皮損可能受突變基因型影響，提示DD的突變基因型與臨床表型之間可能存在一定的相關性。

本研究發(fā)現(xiàn)并證實了一個新的錯義突變，即在患者ATP2A2基因第18外顯子2728位堿基A為G取代（c.2728 A→G），進而導致氨基酸N910D改變。突變位置上，本研究突變c.2728 A→G位于SERCA2的跨膜區(qū)M8，該區(qū)域與另外3個跨膜結(jié)構域M4、M5、M6共同組成SERCA分子的兩個Ca2+結(jié)合位點[13]。推測突變導致該單體的功能缺陷，進而相互影響，導致SERCA2b總體功能上的改變,使表皮內(nèi)角質(zhì)形成細胞的黏附和分化功能發(fā)生異常，最終促使該病發(fā)生。本研究擴大了DD患者ATP2A2基因突變數(shù)據(jù)庫，有助于闡明ATP2A2突變在DD發(fā)病中的分子機制。