郭麗榮，韓高鏈，張楓惠，李俊玲，秦 健，杜 榮*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，山西太谷030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

應(yīng)激是指機(jī)體對內(nèi)外界各種異常刺激所產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)的總和[1]。營養(yǎng)應(yīng)激是一種重要的應(yīng)激，營養(yǎng)素濃度過高或過低均可誘發(fā)營養(yǎng)應(yīng)激[2]。而禁食會使動物處于嚴(yán)重的營養(yǎng)應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體代謝紊亂后必須動員脂肪儲備的能量以保證生命活動的進(jìn)行[3]。脂肪酸從脂肪組織中釋放出來被轉(zhuǎn)移到骨骼肌、心臟以及肝臟的線粒體進(jìn)行氧化分解，產(chǎn)生ATP 供能[4]。有研究通過基因芯片技術(shù)對脂肪組織的功能基因進(jìn)行篩選后初步明確HADHB（Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase/3-ketoacyl-CoA Thiolase/enoyl-CoA Hydratase，beta subunit）基 因 是影響脂類代謝的關(guān)鍵基因之一[5]。HADHB 參與脂肪酸的β 氧化，催化其反應(yīng)的第2 至第4 步，即2- 烯酰輔酶 A 的水合、脂肪酸-2-羥基脂酰輔酶 A 的脫氫以及 β-酮脂酰輔酶 A 的硫解[6-7]。關(guān)于不同動物HADHB 基因的研究有所報(bào)道，例如該基因缺陷的小鼠肝臟會發(fā)生脂肪變性[8]；在被喂食高脂食物的成年雌性斑馬魚體內(nèi)，HADHB 基因mRNA 表達(dá)量上升[9]；HADHB 基因在雞的胚胎時(shí)期即有表達(dá)，且在胚胎發(fā)育后期表達(dá)量最高[10]。但關(guān)于綿羊HADHB 基因的研究目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對綿羊HADHB 基因序列進(jìn)行一系列生物信息分析，預(yù)測該基因的理化性質(zhì)、序列同源性、空間結(jié)構(gòu)以及亞細(xì)胞定位等特性，并通過禁食構(gòu)建營養(yǎng)缺陷應(yīng)激模型，利用qRT-PCR 技術(shù)初步研究HADHB 基因的表達(dá)變化，為進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及樣品采集 隨機(jī)選取6 只體重、月齡相近的雌性成年健康綿羊，分為正常組和禁食組，每組3只。正常組按照常規(guī)的飼養(yǎng)方式飼養(yǎng)，禁食組禁食3 d，禁食期間給予飲水，禁食結(jié)束后正常屠宰，并迅速采取6 份同一部位的骨骼肌組織樣本，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器 超凈工作臺由蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；全自動凝膠成像分析系統(tǒng)、PCR 儀、熒光定量PCR 儀均由美國BIO-RAD 公司生產(chǎn)；電子天平由奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司生產(chǎn)；核酸蛋白濃度測定儀由美國Thermo 公司生產(chǎn)；電泳儀電源及電泳槽由北京六一生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 生物信息學(xué)分析 根據(jù)GenBank 預(yù)測的綿羊HADHB 基因序列（XM_004005732.3）進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

①利用ProtParam（http：//expasy.org/tools/protparam.html）在線軟件分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；②利用ProtScale（http：//expasy.org/tools/protscale.html）在線軟件分析蛋白質(zhì)的親水性與疏水性；③利用TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）在線軟件分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)；④利用EditSeq 和MegAlign 軟件進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；⑤利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；⑥利用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）在線軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；⑦利用PDBsum Generate（http：//www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html）在線軟件評估預(yù)測的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；⑧利用PSORT II（https：//www.genscript.com/psort.html?src=leftbar）在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.4 總RNA 提取及cDNA 合成 首先，將綿羊骨骼肌樣本放入加有液氮的研缽中充分研磨后加入RNAios plus（TaKaRa）提取總RNA。取少量溶解的RNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA 是否降解。其次，用核酸蛋白濃度測定儀測定RNA 濃度。最后，利用PrimeScripTMRT reagent Kit（TaKaRa）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為10 μL： PrimerScriptRTMaster Mix（5×）2 μL，RNA 4 μL，RNase Free water 4 μL，混勻后于PCR 儀中反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 5 min。終止反應(yīng)后對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行濃度測定。

1.5 引物設(shè)計(jì)及合成 選取常用的內(nèi)參基因ACTB（HM067830.1）和GAPDH（HM043737.1），在NCBI設(shè)計(jì)引物并檢測特異性，目的基因引物設(shè)計(jì)及合成方法同內(nèi)參基因。引物序列由北京六合華大基因科技有限公司合成（表1）。

表1 基因PCR 引物序列信息

1.6 熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 體系為20 μL：SYBR Premix Ex TaqTMII（2×）（TaKaRa）10 μL， Forward Primer （10 μmol/L）0.8 μL，Reverse Primer （10 μmol/L）0.8 μL，cDNA （100 ng/μL）2 μL，ddH2O 補(bǔ)足體系至20 μL。qRT-PCR 反應(yīng)條件為95℃2 min，95℃30 s，60℃ 34 s。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 利用NormFinder 軟件對2 個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性評估：分別確定這2 個(gè)基因6 個(gè)樣本熒光定量PCR 得出的CT 值中的最小值，用其余5 個(gè)值分別減去最小值算出ΔCT，并進(jìn)一步計(jì)算出2-ΔCT，再用NormFinder 計(jì)算兩者的穩(wěn)定值M。

目的基因的數(shù)據(jù)處理：根據(jù)2-ΔΔCT計(jì)算目的基因mRNA 的相對表達(dá)量，并利用SPSS 21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析，P＜0.001 表示差異極顯著。用GraphPad PrismTM做柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊HADHB 基因生物信息學(xué)分析

2.1.1 綿羊HADHB 蛋白理化性質(zhì)分析 根據(jù)ProtParam在線軟件分析結(jié)果得出綿羊HADHB 基因編碼的氨基酸數(shù)目為475 個(gè)，其中含量最多的是Ala（A），占比12.2%，其次是Arg（R），占比4.8%，不含Pyl（O）和Sec（U）。負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）數(shù)是42，正電荷殘基（Arg+Lys）數(shù)是55。理論等電點(diǎn)（pI）為9.38，表明HADHB 蛋白為堿性蛋白，其平均疏水性為-0.093，分子式是C2273H3648N630O673S24，分子量是51.3 ku，不穩(wěn)定指數(shù)是34.16，較為穩(wěn)定。在體外哺乳動物網(wǎng)狀細(xì)胞中預(yù)測HADHB 蛋白半衰期為30 h，在酵母體內(nèi)半衰期大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)為大于10 h。

2.1.2 綿羊HADHB 蛋白親水性與疏水性分析 ProtScale對綿羊HADHB 蛋白的親水性和疏水性分析結(jié)果顯示，在氨基酸第242 位的谷氨酰胺親水性最強(qiáng)，數(shù)值是-2.478，第319 位的纈氨酸疏水性最強(qiáng)，數(shù)值是2.067（圖1）。

圖1 綿羊HADHB 蛋白的親水性

2.1.3 綿羊HADHB 蛋白跨膜區(qū)分析 利用TMpred 分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)結(jié)果顯示，從內(nèi)到外有4 個(gè)跨膜區(qū)，分別是138～164、301～322、425～442、450～470 氨基酸位點(diǎn)。從外到內(nèi)有5 個(gè)跨膜區(qū)，分別是450～469、421～442、309～332、295～319、151～176 氨基酸位點(diǎn)（圖2）。

圖2 綿羊HADHB 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.1.4 綿羊HADHB 氨基酸序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 利用EditSeq 和MegAlign 進(jìn)行HADHB 氨基酸序列同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，序列同源性分析結(jié)果顯示（圖3），綿羊HADHB 基因編碼的氨基酸序列與牛（XM_005212929.3）、 山 羊（XM_013967822.2）、 人（XM_024452830.1）、卡氏小鼠（XM_021163089.1）、藏羚羊（XM_005978913.1）、東北狒狒（XM_021924673.1）、非洲鴕鳥南非亞種（XM_009669656.1）相應(yīng)序列的同源性分別為96.4%、98.5%、90.7%、90.3%、99.6%、90.7%、82.7%，表明該基因在不同物種中保守性較高。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，綿羊和山羊、藏羚羊、牛的親緣關(guān)系較近，與藏羚羊親緣關(guān)系最近，與生物分類學(xué)保持一致（圖4）。

圖3 綿羊和其他物種HADHB 氨基酸序列同源性分析

圖4 綿羊HADHB 氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.1.5 綿羊HADHB 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SOPMA在線軟件預(yù)測HADHB 蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈分別占43.58%、6.95%、34.32%、15.16%，α- 螺旋和無規(guī)則卷曲占大多數(shù)（圖5）。

圖5 綿羊HADHB 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.1.6 綿羊HADHB 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過SWISSMODEL 軟件分別預(yù)測綿羊、山羊、藏羚羊、牛HADHB 蛋白的三級結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示（圖6），該蛋白在4 個(gè)物種中均呈四聚體結(jié)構(gòu)，且較為相似，與序列同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析中綿羊、山羊、藏羚羊、牛親緣關(guān)系相近的結(jié)果保持一致。存在大量的α-螺旋和無規(guī)則卷曲，與綿羊HADHB 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果保持一致。

圖6 綿羊、山羊、藏羚羊和牛的HADHB 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.1.7 評估預(yù)測的綿羊HADHB 蛋白三級結(jié)構(gòu) 利用PDBsum Generate 評估預(yù)測的綿羊HADHB 蛋白三級結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示，紅色、棕色以及深黃色區(qū)域三者作為圓點(diǎn)允許出現(xiàn)的區(qū)域，所占比例分別是85.3%、12.1%、2.0%，表明該三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果良好，可信度高（圖7）。

圖7 評估預(yù)測的綿羊HADHB 三級結(jié)構(gòu)

2.1.8 綿羊HADHB 基因亞細(xì)胞定位分析 PSORT II 在線軟件對綿羊HADHB 的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，有91.3%位于線粒體，有4.3%位于細(xì)胞核，還有4.3%位于細(xì)胞質(zhì)。

2.2 熒光定量分析結(jié)果

2.2.1 內(nèi)參基因的確定 候選內(nèi)參基因ACTB 和GAPDH穩(wěn)定性評估結(jié)果中，兩者的穩(wěn)定值M 分別是0.066 和0.302，M 值越小代表穩(wěn)定性越好，所以選擇ACTB 為內(nèi)參基因。

在基因表達(dá)分析中內(nèi)參基因的選擇是十分必要的[11]。本實(shí)驗(yàn)通過對2 個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性的評估，證明ACTB基因在綿羊骨骼肌中的表達(dá)具有更高的穩(wěn)定性，更適合作為該組織基因表達(dá)的內(nèi)參基因。

2.2.2 營養(yǎng)應(yīng)激狀態(tài)下HADHB 基因表達(dá)的變化 qRTPCR 結(jié)果顯示，ACTB 和HADHB 基因擴(kuò)增動力學(xué)曲線和熔解曲線均較為平整，拐點(diǎn)清晰，結(jié)果良好（圖8）。禁食組綿羊HADHB 基因mRNA 相對表達(dá)量與正常組相比極顯著升高了8.9 倍（P＜0.001），說明營養(yǎng)應(yīng)激狀態(tài)下HADHB 基因的表達(dá)上調(diào)（圖9）。

圖8 綿羊ACTB、HADHB 基因qRT-PCR擴(kuò)增動力學(xué)曲線和熔解曲線

圖9 正常組和禁食組綿羊HADHB 基因mRNA 的表達(dá)

3 討 論

HADHB 是脂肪酸β 氧化的重要成員之一，其表達(dá)被靶向抑制后脂肪酸β 氧化也會受到抑制[12]。低乳脂率的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中HADHB 基因高表達(dá)[13]。HADHB 基因編碼4 個(gè)β 亞基，與HADHA 基因編碼的4 個(gè)α 亞基共同構(gòu)成多酶復(fù)合體- 線粒體三功能蛋白（Mitochondrial Trifunctional Protein，MTP）[14]。這2 種亞基的基因突變均有可能導(dǎo)致MTP 活性降低和正常功能的破壞[15]。HADHB 基因缺陷會導(dǎo)致機(jī)體線粒體脂肪酸氧化障礙（Fatty Acid Oxidation Disorder，F(xiàn)AOD），臨床表現(xiàn)為肌張力低下，低血糖甚至發(fā)生腦病[16-17]。

本研究經(jīng)生物信息學(xué)分析得出，綿羊HADHB 蛋白由475 個(gè)氨基酸構(gòu)成，等電點(diǎn)為9.38，屬于堿性蛋白，為日后蛋白質(zhì)的分離、鹽析和變性復(fù)性提供了理論依據(jù)。HADHB 蛋白不穩(wěn)定指數(shù)是34.16，在哺乳動物、酵母、大腸桿菌中均具有較長的半衰期。有研究認(rèn)為，蛋白質(zhì)的半衰期越長其穩(wěn)定性越高[18]，HADHB 蛋白較長的半衰期也在一定程度上反映其較穩(wěn)定的特性。據(jù)此可推斷，HADHB 基因可在真核和原核細(xì)胞中重組，有利于過表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)[19]。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能與其跨膜區(qū)有著密切聯(lián)系，根據(jù)跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果可推斷配體特異性結(jié)合的位點(diǎn)，為HADHB 特異性受體及受體阻斷劑的研究提供了依據(jù)。進(jìn)化樹結(jié)果表明，綿羊HADHB 氨基酸序列與牛、山羊、人、卡氏小鼠、藏羚羊、東北狒狒相應(yīng)序列的同源性均超過90%，說明該基因編碼區(qū)在生物長期進(jìn)化中具有較高的保守性。其中綿羊和山羊、藏羚羊、牛親緣關(guān)系較近，可為未來研究HADHB 在綿羊營養(yǎng)應(yīng)激中的作用提供比較對象。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位顯示該蛋白有91.3%定位于線粒體，與脂肪酸β 氧化的場所一致[20]；同時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，禁食組綿羊HADHB 基因表達(dá)量極顯著升高，因此推斷機(jī)體在營養(yǎng)缺陷應(yīng)激狀態(tài)下，會刺激HADHB 基因表達(dá)增加，促進(jìn)脂肪酸發(fā)生β 氧化，進(jìn)而產(chǎn)生ATP 維持生命活動。根據(jù)綿羊三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果得出該蛋白是一個(gè)四聚體，這種結(jié)構(gòu)是否對脂肪酸的β 氧化有影響還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究首次通過生物信息學(xué)分析對綿羊HADHB蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性進(jìn)行了預(yù)測，通過實(shí)驗(yàn)比較確定ACTB 作為內(nèi)參基因，檢測到營養(yǎng)缺陷應(yīng)激下HADHB 基因mRNA 表達(dá)量顯著上升，為進(jìn)一步深入研究綿羊HADHB 基因在營養(yǎng)應(yīng)激中的作用及其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。