郭麗榮，韓高鏈，張楓惠，李俊玲，秦 健，杜 榮*

（1.山西農業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030801；2.山西農業(yè)大學實驗教學中心，山西太谷030801；3.山西農業(yè)大學生命科學學院，山西太谷 030801）

應激是指機體對內外界各種異常刺激所產生的非特異性應答反應的總和[1]。營養(yǎng)應激是一種重要的應激，營養(yǎng)素濃度過高或過低均可誘發(fā)營養(yǎng)應激[2]。而禁食會使動物處于嚴重的營養(yǎng)應激狀態(tài)，機體代謝紊亂后必須動員脂肪儲備的能量以保證生命活動的進行[3]。脂肪酸從脂肪組織中釋放出來被轉移到骨骼肌、心臟以及肝臟的線粒體進行氧化分解，產生ATP 供能[4]。有研究通過基因芯片技術對脂肪組織的功能基因進行篩選后初步明確HADHB（Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase/3-ketoacyl-CoA Thiolase/enoyl-CoA Hydratase，beta subunit）基 因 是影響脂類代謝的關鍵基因之一[5]。HADHB 參與脂肪酸的β 氧化，催化其反應的第2 至第4 步，即2- 烯酰輔酶 A 的水合、脂肪酸-2-羥基脂酰輔酶 A 的脫氫以及 β-酮脂酰輔酶 A 的硫解[6-7]。關于不同動物HADHB 基因的研究有所報道，例如該基因缺陷的小鼠肝臟會發(fā)生脂肪變性[8]；在被喂食高脂食物的成年雌性斑馬魚體內，HADHB 基因mRNA 表達量上升[9]；HADHB 基因在雞的胚胎時期即有表達，且在胚胎發(fā)育后期表達量最高[10]。但關于綿羊HADHB 基因的研究目前尚未見報道。本實驗對綿羊HADHB 基因序列進行一系列生物信息分析，預測該基因的理化性質、序列同源性、空間結構以及亞細胞定位等特性，并通過禁食構建營養(yǎng)缺陷應激模型，利用qRT-PCR 技術初步研究HADHB 基因的表達變化，為進一步深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品采集 隨機選取6 只體重、月齡相近的雌性成年健康綿羊，分為正常組和禁食組，每組3只。正常組按照常規(guī)的飼養(yǎng)方式飼養(yǎng)，禁食組禁食3 d，禁食期間給予飲水，禁食結束后正常屠宰，并迅速采取6 份同一部位的骨骼肌組織樣本，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器 超凈工作臺由蘇州安泰空氣技術有限公司生產；全自動凝膠成像分析系統(tǒng)、PCR 儀、熒光定量PCR 儀均由美國BIO-RAD 公司生產；電子天平由奧豪斯國際貿易（上海）有限公司生產；核酸蛋白濃度測定儀由美國Thermo 公司生產；電泳儀電源及電泳槽由北京六一生物科技有限公司生產。

1.3 生物信息學分析 根據GenBank 預測的綿羊HADHB 基因序列（XM_004005732.3）進行生物信息學分析。

①利用ProtParam（http：//expasy.org/tools/protparam.html）在線軟件分析蛋白質理化性質；②利用ProtScale（http：//expasy.org/tools/protscale.html）在線軟件分析蛋白質的親水性與疏水性；③利用TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）在線軟件分析蛋白質的跨膜區(qū)；④利用EditSeq 和MegAlign 軟件進行同源性分析和系統(tǒng)進化樹分析；⑤利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線軟件進行蛋白質二級結構預測；⑥利用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）在線軟件進行蛋白質三級結構預測；⑦利用PDBsum Generate（http：//www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html）在線軟件評估預測的蛋白質三級結構；⑧利用PSORT II（https：//www.genscript.com/psort.html?src=leftbar）在線軟件進行亞細胞定位分析。

1.4 總RNA 提取及cDNA 合成 首先，將綿羊骨骼肌樣本放入加有液氮的研缽中充分研磨后加入RNAios plus（TaKaRa）提取總RNA。取少量溶解的RNA 進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA 是否降解。其次，用核酸蛋白濃度測定儀測定RNA 濃度。最后，利用PrimeScripTMRT reagent Kit（TaKaRa）將RNA 反轉錄為cDNA，反應體系為10 μL： PrimerScriptRTMaster Mix（5×）2 μL，RNA 4 μL，RNase Free water 4 μL，混勻后于PCR 儀中反轉錄，反應條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 5 min。終止反應后對反轉錄產物進行濃度測定。

1.5 引物設計及合成 選取常用的內參基因ACTB（HM067830.1）和GAPDH（HM043737.1），在NCBI設計引物并檢測特異性，目的基因引物設計及合成方法同內參基因。引物序列由北京六合華大基因科技有限公司合成（表1）。

表1 基因PCR 引物序列信息

1.6 熒光定量PCR 實時熒光定量PCR 體系為20 μL：SYBR Premix Ex TaqTMII（2×）（TaKaRa）10 μL， Forward Primer （10 μmol/L）0.8 μL，Reverse Primer （10 μmol/L）0.8 μL，cDNA （100 ng/μL）2 μL，ddH2O 補足體系至20 μL。qRT-PCR 反應條件為95℃2 min，95℃30 s，60℃ 34 s。

1.7 統(tǒng)計分析 利用NormFinder 軟件對2 個候選內參基因進行穩(wěn)定性評估：分別確定這2 個基因6 個樣本熒光定量PCR 得出的CT 值中的最小值，用其余5 個值分別減去最小值算出ΔCT，并進一步計算出2-ΔCT，再用NormFinder 計算兩者的穩(wěn)定值M。

目的基因的數據處理：根據2-ΔΔCT計算目的基因mRNA 的相對表達量，并利用SPSS 21.0 進行數據統(tǒng)計和差異顯著性分析，P＜0.001 表示差異極顯著。用GraphPad PrismTM做柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 綿羊HADHB 基因生物信息學分析

2.1.1 綿羊HADHB 蛋白理化性質分析 根據ProtParam在線軟件分析結果得出綿羊HADHB 基因編碼的氨基酸數目為475 個，其中含量最多的是Ala（A），占比12.2%，其次是Arg（R），占比4.8%，不含Pyl（O）和Sec（U）。負電荷殘基（Asp+Glu）數是42，正電荷殘基（Arg+Lys）數是55。理論等電點（pI）為9.38，表明HADHB 蛋白為堿性蛋白，其平均疏水性為-0.093，分子式是C2273H3648N630O673S24，分子量是51.3 ku，不穩(wěn)定指數是34.16，較為穩(wěn)定。在體外哺乳動物網狀細胞中預測HADHB 蛋白半衰期為30 h，在酵母體內半衰期大于20 h，在大腸桿菌體內為大于10 h。

2.1.2 綿羊HADHB 蛋白親水性與疏水性分析 ProtScale對綿羊HADHB 蛋白的親水性和疏水性分析結果顯示，在氨基酸第242 位的谷氨酰胺親水性最強，數值是-2.478，第319 位的纈氨酸疏水性最強，數值是2.067（圖1）。

圖1 綿羊HADHB 蛋白的親水性

2.1.3 綿羊HADHB 蛋白跨膜區(qū)分析 利用TMpred 分析蛋白質的跨膜區(qū)結果顯示，從內到外有4 個跨膜區(qū)，分別是138～164、301～322、425～442、450～470 氨基酸位點。從外到內有5 個跨膜區(qū)，分別是450～469、421～442、309～332、295～319、151～176 氨基酸位點（圖2）。

圖2 綿羊HADHB 蛋白跨膜結構預測

2.1.4 綿羊HADHB 氨基酸序列同源性及系統(tǒng)進化樹分析 利用EditSeq 和MegAlign 進行HADHB 氨基酸序列同源性分析和系統(tǒng)進化樹分析，序列同源性分析結果顯示（圖3），綿羊HADHB 基因編碼的氨基酸序列與牛（XM_005212929.3）、 山 羊（XM_013967822.2）、 人（XM_024452830.1）、卡氏小鼠（XM_021163089.1）、藏羚羊（XM_005978913.1）、東北狒狒（XM_021924673.1）、非洲鴕鳥南非亞種（XM_009669656.1）相應序列的同源性分別為96.4%、98.5%、90.7%、90.3%、99.6%、90.7%、82.7%，表明該基因在不同物種中保守性較高。系統(tǒng)進化樹分析顯示，綿羊和山羊、藏羚羊、牛的親緣關系較近，與藏羚羊親緣關系最近，與生物分類學保持一致（圖4）。

圖3 綿羊和其他物種HADHB 氨基酸序列同源性分析

圖4 綿羊HADHB 氨基酸序列系統(tǒng)進化樹分析

2.1.5 綿羊HADHB 蛋白二級結構預測 利用SOPMA在線軟件預測HADHB 蛋白二級結構，結果顯示二級結構中α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈分別占43.58%、6.95%、34.32%、15.16%，α- 螺旋和無規(guī)則卷曲占大多數（圖5）。

圖5 綿羊HADHB 蛋白二級結構預測

2.1.6 綿羊HADHB 蛋白三級結構預測 通過SWISSMODEL 軟件分別預測綿羊、山羊、藏羚羊、牛HADHB 蛋白的三級結構的結果顯示（圖6），該蛋白在4 個物種中均呈四聚體結構，且較為相似，與序列同源性分析及系統(tǒng)進化樹分析中綿羊、山羊、藏羚羊、牛親緣關系相近的結果保持一致。存在大量的α-螺旋和無規(guī)則卷曲，與綿羊HADHB 蛋白二級結構預測結果保持一致。

圖6 綿羊、山羊、藏羚羊和牛的HADHB 蛋白三級結構預測

2.1.7 評估預測的綿羊HADHB 蛋白三級結構 利用PDBsum Generate 評估預測的綿羊HADHB 蛋白三級結構的結果顯示，紅色、棕色以及深黃色區(qū)域三者作為圓點允許出現的區(qū)域，所占比例分別是85.3%、12.1%、2.0%，表明該三級結構預測結果良好，可信度高（圖7）。

圖7 評估預測的綿羊HADHB 三級結構

2.1.8 綿羊HADHB 基因亞細胞定位分析 PSORT II 在線軟件對綿羊HADHB 的亞細胞定位結果顯示，有91.3%位于線粒體，有4.3%位于細胞核，還有4.3%位于細胞質。

2.2 熒光定量分析結果

2.2.1 內參基因的確定 候選內參基因ACTB 和GAPDH穩(wěn)定性評估結果中，兩者的穩(wěn)定值M 分別是0.066 和0.302，M 值越小代表穩(wěn)定性越好，所以選擇ACTB 為內參基因。

在基因表達分析中內參基因的選擇是十分必要的[11]。本實驗通過對2 個內參基因穩(wěn)定性的評估，證明ACTB基因在綿羊骨骼肌中的表達具有更高的穩(wěn)定性，更適合作為該組織基因表達的內參基因。

2.2.2 營養(yǎng)應激狀態(tài)下HADHB 基因表達的變化 qRTPCR 結果顯示，ACTB 和HADHB 基因擴增動力學曲線和熔解曲線均較為平整，拐點清晰，結果良好（圖8）。禁食組綿羊HADHB 基因mRNA 相對表達量與正常組相比極顯著升高了8.9 倍（P＜0.001），說明營養(yǎng)應激狀態(tài)下HADHB 基因的表達上調（圖9）。

圖8 綿羊ACTB、HADHB 基因qRT-PCR擴增動力學曲線和熔解曲線

圖9 正常組和禁食組綿羊HADHB 基因mRNA 的表達

3 討 論

HADHB 是脂肪酸β 氧化的重要成員之一，其表達被靶向抑制后脂肪酸β 氧化也會受到抑制[12]。低乳脂率的奶牛乳腺上皮細胞中HADHB 基因高表達[13]。HADHB 基因編碼4 個β 亞基，與HADHA 基因編碼的4 個α 亞基共同構成多酶復合體- 線粒體三功能蛋白（Mitochondrial Trifunctional Protein，MTP）[14]。這2 種亞基的基因突變均有可能導致MTP 活性降低和正常功能的破壞[15]。HADHB 基因缺陷會導致機體線粒體脂肪酸氧化障礙（Fatty Acid Oxidation Disorder，FAOD），臨床表現為肌張力低下，低血糖甚至發(fā)生腦病[16-17]。

本研究經生物信息學分析得出，綿羊HADHB 蛋白由475 個氨基酸構成，等電點為9.38，屬于堿性蛋白，為日后蛋白質的分離、鹽析和變性復性提供了理論依據。HADHB 蛋白不穩(wěn)定指數是34.16，在哺乳動物、酵母、大腸桿菌中均具有較長的半衰期。有研究認為，蛋白質的半衰期越長其穩(wěn)定性越高[18]，HADHB 蛋白較長的半衰期也在一定程度上反映其較穩(wěn)定的特性。據此可推斷，HADHB 基因可在真核和原核細胞中重組，有利于過表達載體的構建和表達[19]。蛋白質的結構和功能與其跨膜區(qū)有著密切聯系，根據跨膜區(qū)預測結果可推斷配體特異性結合的位點，為HADHB 特異性受體及受體阻斷劑的研究提供了依據。進化樹結果表明，綿羊HADHB 氨基酸序列與牛、山羊、人、卡氏小鼠、藏羚羊、東北狒狒相應序列的同源性均超過90%，說明該基因編碼區(qū)在生物長期進化中具有較高的保守性。其中綿羊和山羊、藏羚羊、牛親緣關系較近，可為未來研究HADHB 在綿羊營養(yǎng)應激中的作用提供比較對象。蛋白質亞細胞定位顯示該蛋白有91.3%定位于線粒體，與脂肪酸β 氧化的場所一致[20]；同時實時熒光定量PCR 結果顯示，禁食組綿羊HADHB 基因表達量極顯著升高，因此推斷機體在營養(yǎng)缺陷應激狀態(tài)下，會刺激HADHB 基因表達增加，促進脂肪酸發(fā)生β 氧化，進而產生ATP 維持生命活動。根據綿羊三級結構預測結果得出該蛋白是一個四聚體，這種結構是否對脂肪酸的β 氧化有影響還有待進一步研究。

4 結 論

本研究首次通過生物信息學分析對綿羊HADHB蛋白質的理化性質和生物學特性進行了預測，通過實驗比較確定ACTB 作為內參基因，檢測到營養(yǎng)缺陷應激下HADHB 基因mRNA 表達量顯著上升，為進一步深入研究綿羊HADHB 基因在營養(yǎng)應激中的作用及其機制奠定了基礎。