徐澤勤,李立強,谷涌泉,李建新,馮增國,佟 鑄,許 晴,高喜翔,齊一俠,郭建明,張 建*

(1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院血管外科 首都醫(yī)科大學血管外科研究所，北京 100053；2.北京理工大學材料科學與工程學院，北京 100081；3.首都醫(yī)科大學醫(yī)學實驗與檢測中心，北京 100069)

當前心血管疾病是造成死亡的首要原因[1]。對終末期心血管疾病患者常需進行血管重建，以自體血管移植效果較好，然而目前臨床血管重建所需自體血管存在供源有限和尺寸不匹配等缺陷[2]，人工降解血管材料因此受到廣泛關注，但此類材料存在力學性能及生物相容性差等缺點。近年來，國內外學者[3-4]致力于構建組織工程血管的材料學研究,尋找可代替自體血管用于臨床的血管移植物。

血管移植相關動物實驗中，常需對移植物進行血流動力學檢查，超聲技術是目前應用最廣泛的成像方法。但臨床超聲檢查的成像頻率常為12～15 MHz，圖像空間分辨力為300 μm，不足以精確測量小動物移植血管血流動力學相關數(shù)據(jù)。過去十余年中，高頻率成像系統(tǒng)獲得長足發(fā)展，超聲檢查對小動物模型結構成像的空間分辨力進一步提高，并已用于心血管研究領域[5]。本課題組[6]既往研究發(fā)現(xiàn)，肝素表面改性后的聚ε-己內酯[Poly(ε-caprolactone), PCL]材料具有良好的生物相容性。本研究應用超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)檢測PCL-肝素人工血管在大鼠體內血流動力學變化，探討其在大鼠腹主動脈移植模型中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 大鼠腹主動脈移植模型建立 選取雄性Wistar大鼠10只(購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，北京市實驗動物質量合格許可證編號為SCXK:2016-0006)，8～9周齡，體質量300～320 g，中位體質量310.8 g。將大鼠放入麻醉誘導箱，調節(jié)氧氣至1 L/min，調節(jié)恩氟烷至2.5%。全身麻醉大鼠后，將其以俯臥位保定于大鼠專用操作臺，口鼻部置于麻醉面罩內，調節(jié)恩氟烷的維持量為2%～3%。備皮、消毒后，沿腹部正中依次切開皮膚、肌肉直至暴露腹腔。分離腹主動脈前脂肪組織，分離腎下腹主動脈。阻斷腹主動脈后切開血管，采用直徑2 mm、長10 mm的PCL-肝素人工血管(由北京理工大學提供)端端吻合于腹主動脈(圖1A),充分止血后逐層關閉腹腔。

1.2 血流動力學檢查 采用VisualSonics Vevo 2100超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)，MS 550D探頭(中心頻率40 MHz)，焦距7 mm，軸向分辨力和橫向分辨力分別為40 μm和90 μm；分別于建模后1、2、3個月行血流動力學檢查，觀察腹主動脈移植物通暢情況。檢查前對大鼠以恩氟烷進行麻醉，方法同前。分別檢測大鼠腹主動脈近心端吻合口處正常血管、PCL-肝素人工血管及遠心端吻合口處正常血管的血流動力學變化，檢測指標包括血管內徑、管壁厚度及血流速度。

1.3 離體標本觀察 完成末次血流動力學檢查后麻醉大鼠，方法同前。局部消毒后切開皮膚、肌肉直至暴露腹腔。游離PCL-肝素人工血管周圍組織，主要是下腔靜脈、血管周圍纖維結締組織。以動脈夾分別夾閉PCL-肝素人工血管近心端及遠心端，剪斷動脈夾間血管，取出PCL-肝素人工血管，以生理鹽水充分沖洗管腔后，沿血管縱行切開，觀察離體血管形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示，各部位不同時間點間血管內徑、管壁厚度、血流速度比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法；瘤樣擴張與未擴張的PCL-肝素人工血管間血管內徑、管壁厚度、血流速度比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血管形態(tài)改變 建模后1個月，血流動力學檢查未發(fā)現(xiàn)PCL-肝素人工血管呈動脈瘤樣擴張改變(圖2A)；2個月3只大鼠體內移植物出現(xiàn)動脈瘤樣擴張(圖2B)；3個月5只大鼠體內移植物出現(xiàn)動脈瘤樣擴張(圖2C)。

末次血流動力學檢測完成后取材，離體標本觀察證實超聲所見5只大鼠體內PCL-肝素人工血管出現(xiàn)動脈瘤樣擴張(圖1C)，血管內壁蒼白，內膜下可見脂質沉積(圖1E)；其余5只大鼠體內PCL-肝素人工血管形態(tài)均規(guī)則(圖1B)，血管內壁光滑(圖1D)。

2.2 血流動力學指標變化

2.2.1 管壁厚度和血管內徑 建模后1、2、3個月，近心端吻合口處正常血管、遠心端吻合口處正常血管管壁厚度差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，而PCL-肝素人工血管管壁厚度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；兩兩比較，移植模型建立后1個月與2個月(P=0.01)、1個月與3個月(P<0.01)管壁厚度差異均有統(tǒng)計學意義，而2個月與3個月(P=0.06)差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

建模后1、2、3個月近心端吻合口處正常血管、遠心端吻合口處正常血管及PCL-肝素人工血管內徑差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

建模后2個月與3個月瘤樣擴張與未擴張的PCL-肝素人工血管管壁厚度差異無統(tǒng)計學意義(t=1.44、0.07，P=0.20、0.95)；建模后2個月瘤樣擴張與未擴張的PCL-肝素人工血管內徑差異無統(tǒng)計學意義(t=2.35，P=0.06)，而建模后3個月瘤樣擴張的PCL-肝素人工血管內徑明顯大于未擴張者(t=2.94，P=0.03)。見表2。

2.2.2 血流速度 動脈瘤樣擴張PCL-肝素人工血管腔內血流速度明顯下降，聲像圖表現(xiàn)為顏色不一的紊亂血流信號(圖2B)，未擴張PCL-肝素人工血管腔內血流呈正常波峰形態(tài)(圖2A)。建模后1、2、3個月，近心端吻合口處正常血管、遠心端吻合口處正常血管及PCL-肝素人工血管血流速度差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 大鼠腹主動脈移植模型正常血管不同時間血流動力學檢查指標(±s,n=10)

表1 大鼠腹主動脈移植模型正常血管不同時間血流動力學檢查指標(±s,n=10)

檢測時間近心端吻合口處正常血管血管內徑(mm)管壁厚度(mm)血流速度(mm/s)PCL-肝素人工血管血管內徑(mm)管壁厚度(mm)血流速度(mm/s)遠心端吻合口處正常血管血管內徑(mm)管壁厚度(mm)血流速度(mm/s)建模后1個月1.92±0.070.36±0.04808.55±134.481.85±0.120.45±0.06505.76±41.921.87±0.040.31±0.03609.55±62.85建模后2個月1.98±0.120.32±0.05796.23±65.831.83±0.050.63±0.08500.04±80.151.85±0.080.29±0.04635.61±71.43建模后3個月1.94±0.050.33±0.06825.89±109.771.82±0.100.74±0.05560.81±96.341.77±0.150.30±0.03653.72±100.68F值0.400.650.060.0816.920.580.780.140.23P值0.690.550.090.99<0.010.59 0.500.880.80

圖1 PCL-肝素血管移植及取出 A.將PCL-肝素人工血管植入大鼠腹主動脈，建立大鼠腹主動脈移植模型； B.移植模型建立后3個月取材，正常PCL-肝素人工血管形態(tài)； C.移植模型建立后3個月取材，動脈瘤樣擴張PCL-肝素人工血管形態(tài)； D.移植模型建立后3個月取材，正常PCL-肝素人工血管內腔表面； E.移植模型建立后3個月取材，動脈瘤樣擴張PCL-肝素人工血管內腔表面

檢測時間瘤樣擴張(n=5)血管內徑(mm)管壁厚度(mm)血流速度(mm/s)未擴張(n=5)血管內徑(mm)管壁厚度(mm)血流速度(mm/s)建模后1個月———1.85±0.120.45±0.06505.76±41.92建模后2個月2.19±0.310.70±0.05353.85±144.501.83±0.050.63±0.08500.04±80.15建模后3個月2.80±0.660.75±0.28218.30±126.381.82±0.100.74±0.05560.81±96.34

圖2 大鼠腹主動脈移植模型建立后超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)血流動力學檢查 A.建模后1個月PCL-肝素人工血管聲像圖，血管未擴張； B.建模后2個月PCL-肝素人工血管聲像圖，血管呈瘤樣擴張； C.建模后3個月PCL-肝素人工血管聲像圖，血管呈瘤樣擴張

建模后2個月瘤樣擴張與未擴張的PCL-肝素人工血管血流速度差異無統(tǒng)計學意義(t=1.82，P=0.12)，但建模后3個月瘤樣擴張的PCL-肝素人工血管血流速度明顯低于未擴張者(t=4.28，P=0.01)。見表2。

3 討論

生物可降解材料組織工程血管是當前研究熱點之一。聚己內酯因其強度高、降解速率、孔徑人工可調、易加工及在體內降解產(chǎn)物對人體無害等優(yōu)點而廣泛應用于血管組織工程相關領域[7]。肝素含有糖胺聚糖成分，可促進組織生長[6]。與其他細胞外基質相比，多糖可為生物材料提供結合活性物質的位點，同時穩(wěn)定性更高而免疫原性更低[8]。應用靜電紡絲技術制備納米纖維，可模擬天然細胞外基質的結構，有助于細胞生長[9]；通過肝素表面改性后，以這種技術制備的PCL材料血管具有較好的生物學性能[6]。

MRA、CTA等影像學檢查是診斷動脈病變的重要依據(jù)。MRA通過非對比增強和對比增強技術使血管顯像，可評估動脈管腔[10]。近年來迅速發(fā)展的三維時間飛躍法MR血管成像(3D time-of-flight MR angiography, 3D TOF MRA)技術無需注射對比劑，不存在電離輻射，適用于需長期影像學觀察的患者；但MRA檢查費用較為昂貴，掃描時間較長。CTA也可用于評估動脈病變，與MRA相比,主要優(yōu)勢在于圖像采集相對較快，通?？稍? min內完成對主動脈的圖像采集，其主要缺點是存在電離輻射，同時CTA過程中需要使用碘對比劑[10]。超聲血管檢查無需造影劑，不存在電離輻射，且可準確檢測血管及移植物的血流動力學變化[4]；超聲造影以聲諾維(SonoVue)作為血池顯像劑，通過諧波成像技術，可準確監(jiān)測各種臟器的血液微循環(huán)灌注情況。SonoVue不經(jīng)過腎臟代謝，無腎臟毒性，能夠隨呼吸排出體外，動物實驗[4]及臨床研究[11-12]均已證實其安全性。目前超高分辨率小動物超聲已用于評價小鼠心血管及移植物血流動力學相關研究領域[4,13]，還可用于檢測ApoE小鼠腹主動脈瘤中血栓等[14]。

大鼠腹主動脈移植模型可用于評價聚合物材料的生物相容性。本研究應用高分辨動物超聲測量大鼠腹主動脈移植模型PCL-肝素人工血管的血管內徑、管壁厚度、血流速度以及血管移植后通暢情況，發(fā)現(xiàn)人工血管管壁不斷增厚，建模后1、2、3個月差異有統(tǒng)計學意義(F=16.92，P<0.01),但血流狀態(tài)保持穩(wěn)定，建模后1、2、3個月血管內徑及血流速度差異均無統(tǒng)計學意義(F=0.08、0.58，P=0.99、0.59)，即PCL-肝素人工血管移植后生長良好，未發(fā)生血栓形成、管腔狹窄、過度增生等情況。但本研究發(fā)現(xiàn)部分PCL-肝素人工血管出現(xiàn)動脈瘤樣擴張，血流速度明顯降低，具體原因還有待今后進一步實驗分析。

總之，高分辨動物超聲可作為檢測大鼠腹主動脈移植模型的重要實驗工具，具有廣闊應用前景。