陳嘉偉 王衛(wèi)龍 丁雪瑞 趙倩倩 安曉剛 王人鳳 盧連軍

耳聾是人類最常見的感覺神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全世界有超過50%的先天性耳聾由遺傳因素導致[1]?；蛑委熼L期以來被認為是治療遺傳性感音神經(jīng)性耳聾的潛在方法之一，選擇正確的基因載體及合適的載體導入途徑是基因治療的兩個關(guān)鍵因素。利用病毒載體將外源基因?qū)氩溉閯游飪?nèi)耳的研究已有廣泛報道[2～4]，腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)由于其免疫原性低、對人類無致病性以及穩(wěn)定表達時間長等特點，已經(jīng)成為研究基因治療最常用的病毒載體。小鼠是研究遺傳發(fā)育與疾病發(fā)生最常用的模型動物，多種基因修飾小鼠模型的建立為研究遺傳性耳聾帶來了極大便利[5]；然而，由于小鼠耳蝸體積小、存在鐙骨動脈等因素，給手術(shù)操作帶來了一定的困難；因此，采用合適的方法將病毒載體導入內(nèi)耳并表達是基因治療遺傳性耳聾的基礎(chǔ)。本研究采用耳后入路經(jīng)圓窗膜鼓階顯微注射的方法，將帶有綠色熒光蛋白基因的重組腺相關(guān)病毒AAV2/9-GFP導入小鼠耳蝸鼓階，觀察其在內(nèi)耳的表達，為遺傳性耳聾的基因治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗材料 攜帶綠色熒光蛋白(ZsGreen1)的重組腺相關(guān)病毒(AAV2/9-GFP，滴度1.6×1012vg/ml)，購自上海漢恒生物科技有限公司。

1.2實驗動物及分組 健康的5～6周齡野生型C57BL/6J小鼠24只，雌性，體重15～20 g(由空軍軍醫(yī)大學動物實驗中心提供)。隨機分為三組：實驗組12只，人工外淋巴液組6只，均以左耳為手術(shù)耳，分別注射AAV2/9-GFP和人工外淋巴液；空白對照組6只，正常飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.3內(nèi)耳顯微注射方法 動物用4%水合氯醛10 ml/kg體重腹腔注射麻醉成功后，置于37 ℃電熱板維持體溫，眼部涂抹少量紅霉素眼膏保持角膜濕潤，左側(cè)耳后備皮。動物取右側(cè)臥位，術(shù)區(qū)以碘伏消毒，周圍覆蓋無菌紗布，在手術(shù)顯微鏡下，用眼科剪于耳后1～2 mm處剪開皮膚及皮下組織(圖1a)，暴露耳大神經(jīng)及胸鎖乳突肌(圖1b和c)，向上分離牽開胸鎖乳突肌，可見位于其深面的顱外段面神經(jīng)及二腹肌后腹(圖1d)；向后鈍性分離二腹肌后腹，暴露聽泡后壁(圖1e)，用顯微鑷挑除部分聽泡后壁骨質(zhì)，暴露圓窗龕及其下方的鐙骨動脈(圖1f)；用拉制好的玻璃微管穿刺圓窗膜，可見外淋巴液流出(圖1g)，等待3～5分鐘直至外淋巴液外流減緩，用微量上樣針(Eppendorf Microloader)經(jīng)圓窗膜向鼓階內(nèi)緩慢注射2 μl AAV2/9-GFP或人工外淋巴液(圖1h)；取一塊筋膜組織迅速封閉圓窗龕，脂肪塊封閉聽泡骨壁缺損，復位耳后肌肉，用5-0可吸收縫線分層縫合切口，碘伏消毒切口皮膚。

1.4聽性腦干反應(ABR)測試 三組動物術(shù)后均存活，術(shù)后第21 d進行ABR測試。測試儀器為TDT system3(Tucker-Davis Technologies，美國)，小鼠麻醉后置于隔聲室內(nèi)，取俯臥位，記錄電極置于顱頂正中，參考電極置于耳后，地線接尾部；選用短純音(tone burst)為刺激聲，上升/下降平臺為10 ms，疊加1 024次，給聲強度從90 dB以5 dB遞減，依次測試4、8、16、32 kHz，以能重復引出可辨波Ⅰ的最小刺激強度為反應閾。

1.5耳蝸解剖及免疫熒光染色 術(shù)后21 d完成ABR測試后處死動物，迅速剪下頭部，沿枕骨大孔剪開頂骨，去除腦組織，向兩側(cè)分開暴露顳骨內(nèi)面，取出耳蝸置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中，在體式顯微鏡下摘除鐙骨，開放前庭窗與蝸窗，并于蝸頂打孔，4 ℃固定過夜；10%EDTA溶液4 ℃脫鈣7 d(每2～3 d換液一次)；在體式顯微鏡下用Vannas彈簧剪將耳蝸分為底回、中回、頂回三部分，去除蝸殼、螺旋韌帶及前庭膜，將耳蝸基底膜移入96孔板。

耳蝸基底膜用1%TritonX-100透化15 min，PBS漂洗3遍(每次5 min)，5%驢血清封閉45 min。PBS漂洗3遍(每次5 min)，加入1∶1 000稀釋兔源Myosin VIIa一抗(Proteus Bioscience，美國)50 μl，4 ℃孵育48 h。PBS漂洗3遍(脫色搖床，30 min)，加入1∶200稀釋驢抗兔594 nm二抗(Thermo Fisher Scientific，美國)50 μl，4℃避光孵育過夜；PBS漂洗3遍(脫色搖床，30 min)，加入50 μl DAPI室溫30 min；PBS漂洗3遍(每次5min)，80%甘油溶液封片，激光共聚焦顯微鏡(Nikon，日本)觀察并拍照。以200 μm為計數(shù)單位對基底膜各段內(nèi)毛細胞總數(shù)及GFP陽性內(nèi)毛細胞個數(shù)進行計數(shù)，計算轉(zhuǎn)染效率。

圖1 耳后徑路經(jīng)圓窗膜鼓階顯微注射的手術(shù)步驟 a.皮膚切口;b和c.剪開皮膚和皮下組織可見:耳大神經(jīng)(GAN),胸鎖乳突肌(SCM);d.牽開胸鎖乳突肌,可見位于深面的面神經(jīng)(FN)和二腹肌后腹(PBD);e.向后鈍性分離二腹肌后腹,暴露聽泡后壁(TB);f.挑除部分聽泡后壁骨質(zhì),暴露圓窗龕(RWN)及其下方的鐙骨動脈(SA);g.用玻璃微管(MP)穿刺圓窗膜;h.用微量上樣針(ML)經(jīng)圓窗膜向鼓階內(nèi)注射病毒載體

圖2 實驗組耳蝸基底膜鋪片激光共聚焦顯微鏡觀察 轉(zhuǎn)染21 d后可見耳蝸基底膜底回至頂回均有GFP表達,主要轉(zhuǎn)染內(nèi)毛細胞,轉(zhuǎn)染陽性細胞呈逐漸減少的趨勢(×600)

1.6統(tǒng)計學方法 三組動物各頻率ABR閾值差異比較采用SPSS23軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD法，各段耳蝸基底膜內(nèi)毛細胞轉(zhuǎn)染效率差異比較采用3×2表χ2檢驗(Chi-square test)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

術(shù)后動物均存活，未見步態(tài)不穩(wěn)、頭部傾斜等前庭功能障礙表現(xiàn)。

2.1各組ABR反應閾比較 實驗組及人工外淋巴液組動物左耳ABR各頻率閾值均不同程度升高，與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組與人工外淋巴液組動物左耳ABR各頻率反應閾比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各組動物右耳ABR各頻率反應閾比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

2.2耳蝸組織大體觀察 各組動物取材時見中耳腔清潔、干燥，無炎癥反應及膿、血性分泌物，聽骨鏈完整。圓窗龕內(nèi)填塞的筋膜已纖維化，部分動物圓窗龕內(nèi)可見少許陳舊血性分泌物。

表1 各組動物術(shù)后21 d左、右耳tb-ABR各頻率反應閾

2.3耳蝸基底膜激光共聚焦顯微鏡觀察 鏡下可見耳蝸基底膜上整齊排列的一排內(nèi)毛細胞與三排外毛細胞。實驗組動物左耳從基底膜底回至頂回均可見GFP表達，轉(zhuǎn)染陽性細胞呈逐漸減少的趨勢(圖2)；底回、中回及頂回的內(nèi)毛細胞平均轉(zhuǎn)染效率從高到低分別為82.7%、75.0%、44.7%，底回與頂回、中回與頂回轉(zhuǎn)染效率比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，底回與中回轉(zhuǎn)染效率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。AAV2/9-GFP主要轉(zhuǎn)染內(nèi)毛細胞，轉(zhuǎn)染陽性細胞形態(tài)正常，未見萎縮、脫落等細胞毒性表現(xiàn)；外毛細胞未見GFP表達。實驗組動物對側(cè)耳、人工外淋巴液組及空白對照組均未見GFP表達。

3 討論

在基因治療遺傳性耳聾的研究中，腺病毒(adenovirus，Ad)和腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)是兩種常用的病毒載體，但腺病毒轉(zhuǎn)染后不整合至宿主細胞內(nèi)，維持表達時間短，且腺病毒的免疫原性較高，這些都限制了其在基因治療中的應用[6]。腺相關(guān)病毒能夠有效轉(zhuǎn)染內(nèi)耳毛細胞、支持細胞并整合至宿主的基因組上，使外源基因在宿主細胞內(nèi)長期穩(wěn)定表達，改變細胞表型，糾正遺傳缺陷[7,8]。腺相關(guān)病毒是復制缺陷病毒，免疫原性極低，對人類無致病性，動物實驗證明其無耳毒性[3]，是遺傳性耳聾基因治療的理想載體。不同血清型的腺相關(guān)病毒對動物內(nèi)耳的轉(zhuǎn)染能力有一定差異[9]，有研究表明腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)耳主要局限于內(nèi)毛細胞，而外毛細胞幾乎沒有轉(zhuǎn)染[10,11]；本研究結(jié)果與之類似。Bence等[12]發(fā)現(xiàn)外泌體相關(guān)腺相關(guān)病毒(exosome-associated AAV)具有比傳統(tǒng)腺相關(guān)病毒更高的轉(zhuǎn)染效率，并能夠轉(zhuǎn)染外毛細胞，這可能成為遺傳性耳聾基因治療的一個發(fā)展方向。本研究采用AAV2/9-GFP作為載體，經(jīng)圓窗膜鼓階顯微注射轉(zhuǎn)染小鼠耳蝸，于術(shù)后21天觀察，發(fā)現(xiàn)從耳蝸底回到頂回內(nèi)毛細胞均可見GFP表達，且實驗組與人工外淋巴液組術(shù)耳ABR反應閾無差異，說明其安全，無耳毒性。

小鼠是研究遺傳性耳聾的理想模型動物，但由于其耳蝸體積小，術(shù)中觀察、操作較為困難。此外，與人類不同的是，嚙齒類動物的鐙骨動脈在出生后不發(fā)生退化，其從頸內(nèi)動脈分出后穿過二腹肌后腹進入聽泡，緊鄰圓窗龕的正下方走行，并穿過鐙骨兩弓之間，如術(shù)中不慎損傷會發(fā)生難以控制的大出血[13，14]。本研究操作過程中的體會是：在暴露聽泡時，應將二腹肌后腹從聽泡表面鈍性向后分離，充分暴露聽泡后壁，從面神經(jīng)穿出聽泡處(莖乳孔)的后上方挑開部分骨壁，即可直接暴露圓窗龕及其下方的鐙骨動脈；穿刺圓窗膜之前，如果中耳腔有出血，應用明膠海綿拭凈，防止血液沿圓窗進入內(nèi)耳。穿刺圓窗膜后可見外淋巴液流出，等待數(shù)分鐘至其外流停止再進行注射，可以防止外淋巴液將病毒載體沖出而導致注射失敗。整個操作過程中應注意保護面神經(jīng)，防止因損傷面神經(jīng)造成動物術(shù)后無法閉眼、正常進食甚至死亡。

耳蝸經(jīng)固定、脫鈣后，基底膜脆性增加，在去除蝸殼和螺旋韌帶的過程中極易發(fā)生基底膜損傷和斷裂。此外，由于小鼠的蝸管圍繞蝸軸盤旋2周，豚鼠蝸管盤旋可達4周[15]，將整個基底膜直接鋪片易發(fā)生褶皺、重疊，影響之后的染色觀察。本研究采用“分段鋪片”法，先將耳蝸分為底、中、頂回三部分，再沿外側(cè)螺旋溝一并剪除螺旋韌帶及蝸殼；此方法可操作性強，不易損傷基底膜，鋪片時不發(fā)生折疊，并可對同一基底膜進行不同標記物的染色觀察。

內(nèi)耳基因?qū)氲氖中g(shù)入路一般有耳后入路和腹側(cè)入路[16]。常用的載體導入途徑有經(jīng)圓窗膜穿刺鼓階導入、經(jīng)耳蝸開窗鼓階或中階導入、完整圓窗膜滲透導入、經(jīng)后半規(guī)管開窗導入等。經(jīng)圓窗膜穿刺鼓階導入途徑解剖標志清晰、導入確切、可操作性強，但由于破壞了圓窗膜的完整性，術(shù)后可能遺留聽力損失[17,18]。經(jīng)耳蝸開窗導入途徑保留了完整的圓窗膜，但在打孔時可能造成耳蝸基底回損傷，從而導致高頻聽力損失[19]；該方法可導入鼓階或中階，小鼠耳蝸中階內(nèi)淋巴液體積約為0.19 μl，前庭階和鼓階外淋巴液體積約為0.6 μl，可根據(jù)所需病毒的體積選擇導入部位[20]。完整圓窗膜滲透導入途徑是將浸有病毒載體的明膠海綿填塞于圓窗龕內(nèi)，病毒載體依靠滲透作用透過圓窗膜導入鼓階外淋巴液，其轉(zhuǎn)染效率較低。最近有研究發(fā)現(xiàn)利用膠原酶或透明質(zhì)酸預先處理圓窗膜后進行完整圓窗膜滲透導入，轉(zhuǎn)染效率接近經(jīng)圓窗膜穿刺或經(jīng)耳蝸開窗導入途徑，且保留了內(nèi)耳的完整性，無聽力損失[21,22]。經(jīng)后半規(guī)管開窗導入途徑是在后半規(guī)管骨壁打孔，將病毒載體導入內(nèi)耳，對前庭和耳蝸均有較高的轉(zhuǎn)染效率；此方法無需打開聽泡，保留了正常的中耳結(jié)構(gòu)，能夠更好地保存聽力，缺點是無法確切辨認導入至內(nèi)淋巴液或外淋巴液，且可能造成前庭功能損傷[23,24]。本研究采用經(jīng)圓窗膜鼓階顯微注射導入載體，取得了良好的轉(zhuǎn)染效率，但術(shù)耳的ABR反應閾較空白對照組升高。

本研究發(fā)現(xiàn)AAV2/9-GFP經(jīng)圓窗膜鼓階顯微注射后在耳蝸底回、中回的轉(zhuǎn)染效率高于頂回，可能與病毒載體的導入位點有關(guān)，經(jīng)圓窗膜途徑導入使靠近底回的外淋巴液中病毒滴度較高，而較難擴散至頂回。本研究中實驗組和人工外淋巴液組動物術(shù)側(cè)耳在術(shù)后均發(fā)生了聽力損失，分析其可能的原因有：①液體注射過程對內(nèi)耳造成的機械損傷；②圓窗封閉或圓窗發(fā)生骨化，限制了外淋巴液的波動；③聽泡骨壁缺損處填塞的脂肪塊影響聽骨鏈的正?；顒印Ｒ虼?，如何在導入外源基因的同時維持正常的中耳及內(nèi)耳結(jié)構(gòu)、避免發(fā)生聽力損失是一個值得深入研究和探討的問題。

本研究采用經(jīng)圓窗膜鼓階顯微注射的方法將AAV2/9-GFP導入小鼠耳蝸，結(jié)果顯示其能夠在內(nèi)耳毛細胞中表達，且轉(zhuǎn)染陽性細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，說明該方法可行，為研究腺相關(guān)病毒載體在遺傳性耳聾基因治療中的臨床應用提供了實驗基礎(chǔ)。