盧偉強(qiáng)，毛銀，李國(guó)輝，鄧禹*，趙運(yùn)英*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

在傳統(tǒng)方法中，一般是利用硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌[9]來去除污水中的氮。硝化細(xì)菌可在有氧條件下將氨氧化成亞硝酸鹽或硝酸鹽，但是生長(zhǎng)速度緩慢。而大多數(shù)反硝化細(xì)菌是異養(yǎng)厭氧菌，以亞硝酸鹽或硝酸鹽為電子受體并生成氮?dú)鈁3]，因此傳統(tǒng)方法去除氮對(duì)設(shè)備要求較高，所用時(shí)間較長(zhǎng)。而脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化一體的特點(diǎn)，具有很好的脫氮能力[10]。為了有效利用資源，通常對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定化和回收利用[11]。例如SANJEEVKUMAR使用固定化細(xì)胞去除N,N-二甲基甲酰胺(DMF)[12]，這些土壤微生物的巨大潛力已被強(qiáng)化用于去除到培養(yǎng)瓶中的DMF[13]，在合適的基質(zhì)中截留的細(xì)菌細(xì)胞已被證明能提高對(duì)多種有毒和頑抗性化合物的耐受性[14]。固定化細(xì)胞可以通過更高的細(xì)胞載量維持去除速率，易于生物過程維持[12]。因此，固定化細(xì)胞可作為生物修復(fù)環(huán)境的一種較好的選擇[15]。由于這些明顯的優(yōu)點(diǎn)，固定化細(xì)胞已被用于去除水體中的許多污染物[16-17]，固定化細(xì)胞還被用于食品工業(yè)[18]，生物轉(zhuǎn)化[19]，生物乙醇生產(chǎn)[20]和微生物凈化水體[21]。

本研究探究了海藻酸鈉(sodium alginate，SA)與幾種不同的二價(jià)金屬陽離子絡(luò)合形成的水凝膠在污水處理中的效果。通過正交試驗(yàn)確定固定化條件，并測(cè)定了固定化細(xì)胞使用的循環(huán)次數(shù)，最終目的是加快P.denitrificans在廢水處理中的推廣和應(yīng)用，特別是對(duì)含氮量較高的廢水的處理。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

脫氮副球菌P.denitrificansDYTN-1(菌種編號(hào)CCTCC 2016741)來自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。富集培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10.0，蛋白胨10.0，酵母提取物5.0。模擬污水培養(yǎng)基(g/L)[22]: KNO30.25，(NH4)2SO40.154，NaNO20.16，KH2PO40.05，K2HPO40.05，NaCl 3.0，C6H12O62.5,微量元素溶液1 mL/L。微量元素溶液(g/L)：MgSO4·7H2O 10.0，ZnSO4·7H2O 2.2，CaCl2·2H2O 7.3，MnCl2·4H2O 2.5，CoCl2·6H2O 0.5，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0，CuSO4·5H2O 0.2，EDTA-2Na 20.0。模擬污水培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)至7.0。

1.2 脫氮副球菌DYTN-1的富集

脫氮副球菌DYTN-1在富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集[23]，并且當(dāng)游離細(xì)胞的OD600nm=4.0時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定化。7 500 r/min離心10 min，收集菌體，并用磷酸緩沖液洗滌2次供下一步使用[12]。

1.3 固定化脫氮副球菌DYTN-1

采用海藻酸鈉對(duì)細(xì)胞DYTN-1進(jìn)行固定化，用磁力攪拌器將一定濃度的海藻酸鈉與離心后的菌體混合均勻。使用注射式造粒機(jī)將上述混合物滴落至二價(jià)金屬陽離子的溶液中，置于2～4 ℃環(huán)境中交聯(lián)3～5 h以形成珠粒(直徑為3～4 mm)。形成的珠粒用無菌水洗滌3～5次，置于4 ℃冰箱中供下一步使用。將固定化后的細(xì)胞放入污水中，測(cè)定固定化細(xì)胞是否對(duì)污水中的總氮具有去除效果。如果對(duì)污水中的總氮沒有去除效果，則說明固定化細(xì)胞已經(jīng)失活。

1.4 測(cè)定方法

采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法[24]測(cè)定TN。以TN含量(mg/L)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的Ar值為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線。

Ab=Ab220-2Ab275

(1)

As=As220-2As275

(2)

Ar=As-Ab

(3)

式中：Ab,零濃度(空白)溶液的校正吸光度；Ab220,零濃度(空白)溶液于波長(zhǎng)220 nm處的吸光度；Ab275,零濃度(空白)溶液于波長(zhǎng)275 nm處的吸光度；As，標(biāo)準(zhǔn)溶液的校正吸光度;As220，標(biāo)準(zhǔn)溶液于波長(zhǎng)220 nm處的吸光度；As275，標(biāo)準(zhǔn)溶液于波長(zhǎng)275 nm處的吸光度；Ar，標(biāo)準(zhǔn)溶液校正吸光度與零濃度(空白)溶液校正吸光度的差。

配制硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)使用液，按照堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法[24]測(cè)定TN，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 TN標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 TN standard curve

由圖1可以看出，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.999 3，因此可以進(jìn)行TN的測(cè)定。

1.5 設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)

為了找到固定化細(xì)胞去除廢水中總氮的最佳條件，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)來研究以下4個(gè)因素對(duì)固定化細(xì)胞的影響：海藻酸鈉濃度，海藻酸鈉與菌株的比例，交聯(lián)劑的濃度和固定的時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離狀態(tài)下脫氮副球菌DYTN-1去除工業(yè)污水中的總氮

為了研究游離狀態(tài)下脫氮副球菌DYTN-1對(duì)去除污水中總氮的影響，分別設(shè)置DYTN-1的接種量為1%、2%、3%和4%，置于30 ℃，200 r/min的條件下培養(yǎng)。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[24]測(cè)定污水中總氮的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，總氮的去除效果與脫氮副球菌DYTN-1的接種量呈顯著的正相關(guān)。接種量為1%～2%需48 h才能將總氮含量降低至國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn)[25](圖2-a和圖2-b)。但當(dāng)接種量為3%～4%時(shí)，污水中的總氮在24 h內(nèi)總氮含量達(dá)到國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn)，總氮含量在接下來的48 h內(nèi)變化不大(圖2-c和圖2-d)?；谝陨涎芯靠梢钥闯?，脫氮副球菌DYTN-1在處理廢水方面具有很大的潛力。為了能夠有效循環(huán)利用脫氮副球菌DYTN-1，采用細(xì)胞固定化技術(shù)對(duì)DYTN-1進(jìn)行固定化。

2.2 不同二價(jià)金屬離子與海藻酸鈉交聯(lián)對(duì)固定化細(xì)胞去除污水中總氮的影響

海藻酸鈉是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇之后的副產(chǎn)物，其分子由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic，M)和α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronic，G)按(1→4)鍵連接而成，是固定化細(xì)胞的理想載體，對(duì)微生物無毒性[26]。

2.2.1 測(cè)試不同的二價(jià)金屬離子作為交聯(lián)劑對(duì)固定化細(xì)胞的影響

(a)至(d)-DYTN-1的接種量分別為1%，2%，3%和4%圖2 不同接種量的DYTN-1對(duì)去除污水中總氮的影響Fig.2 Effect of different inoculation amount of DYTN-1 on removal TN from wastewater

分別采用Ca2+、Zn2+、Ba2+、Cu2+、Co2+和Mg2+作為交聯(lián)劑，研究上述6種二價(jià)金屬離子與海藻酸鈉交聯(lián)生成的水凝膠是否具有細(xì)胞活性(表1)。發(fā)現(xiàn)Mg2+作為交聯(lián)劑不能形成水凝膠，而Zn2+、Cu2+和Co2+分別作為交聯(lián)劑能夠形成水凝膠，但沒有細(xì)胞活性。只有以Ca2+和Ba2+為交聯(lián)劑形成的水凝膠具有細(xì)胞活性，能有效去除廢水中的總氮。

表1 不同二價(jià)金屬陽離子作為交聯(lián)劑的比較Table 1 Different two valence cations are used ascrosslinking agents

注：+:形成的水凝膠具有細(xì)胞活性；-:形成的水凝膠無細(xì)胞活性；*:未能形成水凝膠

2.2.2 測(cè)定具有活性的固定化細(xì)胞對(duì)污水中總氮的去除效果

使用2種不同的二價(jià)金屬陽離子Ca2+和Ba2+作為交聯(lián)劑，并測(cè)定了固定化細(xì)胞去除廢水中總氮的效果。發(fā)現(xiàn)固定化細(xì)胞的去除效率比游離細(xì)胞的去除效率更高，使用Ca2+、Ba2+作為交聯(lián)劑，所形成的水凝膠能夠分別在4、8 h內(nèi)將廢水中的總氮含量降低至10 mg/L以下(圖3)。

2.3 固定化脫氮副球菌DYTN-1去除污水中總氮的最佳條件

2.3.1 兩種不同交聯(lián)劑形成水凝膠循環(huán)使用的次數(shù)

為了測(cè)定2種不同交聯(lián)劑形成的水凝膠的循環(huán)使用次數(shù)，分別將Ca2+、Ba2+作為交聯(lián)劑形成的水凝膠放入模擬的污水培養(yǎng)基中，并測(cè)定使得污水中的總氮含量達(dá)到國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn)時(shí)重復(fù)使用的次數(shù)。將上述2種水凝膠放入模擬的污水中，當(dāng)污水中總氮含量達(dá)到國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，用紗布將水凝膠截留下來，并注入新的污水，直至水凝膠破裂，對(duì)這2種交聯(lián)劑形成的水凝膠循環(huán)使用的次數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果表明，Ba2+作為交聯(lián)劑形成水凝膠的使用次數(shù)為9次，明顯高于Ca2+(5次)。

2.3.2 固定化脫氮副球菌DYTN-1去除污水中總氮的最佳條件

設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)來考察海藻酸鈉濃度，海藻酸鈉與菌株的比例，交聯(lián)劑的濃度以及固定化時(shí)間對(duì)固定化細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，不同條件下形成的水凝膠在去除效率上存在顯著差異。在實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)4和實(shí)驗(yàn)8中(表2)，總氮去除率均高于80%。實(shí)驗(yàn)8的去除效果顯著，去除率為87.6%，而實(shí)驗(yàn)9則沒有明顯的去除效果，去除率幾乎為零。因此，不同條件下形成的水凝膠對(duì)去除污水中總氮的影響很大。由表2可以看出，各因素影響的主次為SA與菌種比例>固定化時(shí)間>氯化鋇濃度>SA含量，通過效應(yīng)曲線(圖4)，得到最佳的實(shí)驗(yàn)條件：SA含量為3%，SA與菌種比例為1∶1，氯化鋇濃度為0.1 mol/L，固定化時(shí)間為5 h。

a-鈣離子作為交聯(lián)劑；b-鋇離子作為交聯(lián)劑圖3 不同二價(jià)金屬離子交聯(lián)對(duì)固定化細(xì)胞去除廢水中總氮的影響Fig.3 Effect of cross-linking of different divalent metal ions on removal TN from wastewater by immobilized cells

表2 正交實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Table 2 The content and determination results oforthogonal test

注： *，實(shí)驗(yàn)2中,由于海藻酸鈉與菌種濃度過低未能形成水凝膠，因此設(shè)定其去除率為0

圖4 固定化DYTN-1細(xì)胞最佳條件的效應(yīng)曲線Fig.4 The effective curve of the optimum conditions forimmobilization DYTN-1 cells

為了驗(yàn)證正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在上述最佳的條件下對(duì)脫氮副球菌進(jìn)行了固定化，并測(cè)定了固定化細(xì)胞去除污水中總氮的效果。從第3批污水開始，固定化的脫氮副球菌DYTN-1細(xì)胞可在3 h內(nèi)將廢水中總氮的濃度降低至20 mg/L以下(圖5)。第1批廢水中總氮含量達(dá)到國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn)需要8 h。第2批次總氮的去除速度明顯加快，運(yùn)行至第4 h時(shí)總氮含量已低于20 mg/L。在處理第3批污水時(shí)，總氮含量在2.5 h后達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，比第2批縮短37.5%，比第1批縮短68.75%。到第4批時(shí)，污水中總氮達(dá)到國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn)所需時(shí)間為2 h，比第一批所用的時(shí)間縮短了6 h。處理第5批污水時(shí)，僅1 h時(shí)內(nèi)污水中總氮含量已經(jīng)低于20 mg/L。在后面的批次中，基本在1 h內(nèi)使得污水中總氮含量達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)，由于固定化細(xì)胞可以通過更高的細(xì)胞載量維持去除速率，易于生物過程維持，固定化后形成的水凝膠里面的細(xì)胞數(shù)量不斷增加，對(duì)污水的總氮利用效率不斷提高，所用的時(shí)間不斷減少。在最佳條件下固定化細(xì)胞能夠循環(huán)使用12次，與在一般條件下固定化的細(xì)胞(9次)相比，循環(huán)次數(shù)增加了33.3%。

3 結(jié)論

本研究確定了1株可用于去除污水中總氮的脫氮副球菌DYTN-1。為了進(jìn)一步提高脫氮副球菌DYTN-1對(duì)污水中總氮的去除效率，以海藻酸鈉為載體，以Ba2+為交聯(lián)劑對(duì)脫氮副球菌DYTN-1進(jìn)行細(xì)胞固定化。固定化的最佳條件為:SA含量為3%，SA與菌種比例為1∶1，BaCl2濃度為0.1 mol/L，固定化時(shí)間為5 h。結(jié)果表明，固定化細(xì)胞能夠明顯提高廢水中總氮的去除效率，顯著降低運(yùn)行周期，而且固定化后的細(xì)胞可多次重復(fù)使用。因此，本研究為去除廢水中的總氮提供了一種經(jīng)濟(jì)有效的方法。

圖5 固定化細(xì)胞在最佳條件下去除污水中的總氮Fig.5 Immobilized cells remove TN from wastewater under optimal conditions. Error bars represents the standard deviations注：圖中數(shù)字表示循環(huán)次數(shù)