張玉富，熊海波，徐慶陽(yáng)1,2,*，陳寧1,2,

1(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))，天津，300457) 2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))，天津，300457) 3(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)

常見(jiàn)的20種氨基酸中，L-亮氨酸(L-Leu)與L-異亮氨酸、L-纈氨酸稱為分支鏈氨基酸[1]。3種分支鏈氨基酸的生物合成途徑，部分共享相同的前體物質(zhì)和酶[2]。L-Leu在醫(yī)藥、動(dòng)物飼料、食品、化妝品等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道L-Leu在刺激肌肉蛋白合成和維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中具有重要作用[4]。L-Leu也被用作一種調(diào)味劑和片劑生產(chǎn)的潤(rùn)滑劑[5]。與其他大部分L-氨基酸的生產(chǎn)相似，微生物發(fā)酵法是當(dāng)前工業(yè)生產(chǎn)L-Leu的主要方法[6]，發(fā)酵生產(chǎn)L-Leu的菌種主要是谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌[7]。

生物素是所有生物體都需要的水溶性維生素，因?yàn)樗谔钱惿⒅舅岷铣?、氨基酸分解等代謝途徑中的羧化反應(yīng)中扮演著不可或缺的角色[8]。LI等[9]在初始培養(yǎng)基添加適量生物素，發(fā)酵中期補(bǔ)充一定量生物素，顯著提高了α-酮戊二酸的產(chǎn)量。由于生物精煉過(guò)程中生物素保持穩(wěn)定，玉米秸稈水解液中生物素含量高，Corynebacteriumglutamicum產(chǎn)谷氨酸量極少[10]。生物素不足，抑制谷氨酸棒桿菌的生長(zhǎng)，而生物素過(guò)量影響谷氨酸的分泌[10-12]，生產(chǎn)過(guò)程通過(guò)添加Tween[13]、青霉素[14]、乙胺丁醇[15]或者控制溫度[16]提高谷氨酸的產(chǎn)量。生物素對(duì)Corynebacteriumglutamicum生長(zhǎng)狀態(tài)及產(chǎn)谷氨酸影響機(jī)制已被報(bào)道[17-18]。生物素對(duì)黃色短桿菌產(chǎn)L-Leu的影響未見(jiàn)報(bào)道，本文考察了不同濃度生物素對(duì)L-Leu發(fā)酵的影響，并運(yùn)用膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵技術(shù)，使L-Leu產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率顯著提高，副產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸(L-Ala)含量減少。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)TK0303(Met-+IleL+2-TAr+α-ABr+β-HLr+Rifr+SGr)，天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

見(jiàn)參考文獻(xiàn)[19]。

1.1.3 主要儀器

發(fā)酵罐(5、30 L全自動(dòng)發(fā)酵罐)，上海保興生物設(shè)備工程公司；SBA-40C生物傳感儀，山東科學(xué)院生物研究所；pH電極、溶氧電極，METTLER TOLEDO；LC20AT高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；TU 1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器；FA2204B電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 接種量對(duì)搖瓶分批發(fā)酵黃色短桿菌產(chǎn)L-Leu的影響

用接種環(huán)取1環(huán)斜面活化菌種，接種于錐形瓶，31 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，作為種子液。按照2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%接種量分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，31 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，氨水調(diào)節(jié)pH值至7.0，每個(gè)處理進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)培養(yǎng)44 h后不同接種量下L-Leu的濃度。

1.2.2 種子培養(yǎng)

吸取適量無(wú)菌生理鹽水于5支活化斜面中，將菌懸液接入5 L種子罐中，初始通氣量1 L/min；攪拌轉(zhuǎn)速300～700 r/min；通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制pH在7.0；培養(yǎng)溫度31 ℃；以泡敵消泡；培養(yǎng)16 h后，按一定接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.2.3 30 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵

按搖瓶分批發(fā)酵最適接種量將種子液接入30 L發(fā)酵罐中；初始通氣量2 L/min；攪拌轉(zhuǎn)速500～800 r/min；通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制pH值在7.0；培養(yǎng)溫度31 ℃；以泡敵消泡；發(fā)酵過(guò)程中，葡萄糖按一定的流加方式補(bǔ)入；發(fā)酵周期44 h[20]。發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加20、50、80、120 μg/L生物素，通過(guò)四聯(lián)發(fā)酵罐同時(shí)進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，重復(fù)3個(gè)批次。

1.2.4 膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵

見(jiàn)參考文獻(xiàn)[21]。

1.3 分析方法

1.3.1 菌體濃度測(cè)定

每隔4 h取適量發(fā)酵液，滅菌生理鹽水適當(dāng)倍數(shù)稀釋，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下吸光度。

1.3.2 溶氧及pH值測(cè)定

在線測(cè)定。

1.3.3 葡萄糖濃度

取適量發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，用生物傳感儀測(cè)定。

1.3.4L-Leu及L-Ala濃度

發(fā)酵液中L-Leu/L-Ala濃度用高效液相色譜法分析測(cè)定[19]。采用Agilent C18(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)色譜柱，衍生劑為2,4-二硝基氟苯，柱前衍生，流動(dòng)相為50%的乙腈、4.1 g/L的醋酸鈉溶液，柱溫33 ℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 接種量對(duì)搖瓶分批發(fā)酵黃色短桿菌產(chǎn)L-Leu的影響

通過(guò)搖瓶分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察了不同接種量對(duì)L-Leu產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖1所示。接種量為2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)L-Leu的產(chǎn)量分別為13.3、15.0、15.8、18.2、22.5、21.0、20.5 g/L。其中接種量為10%時(shí)，L-Leu的產(chǎn)量最高，而接種量過(guò)高或者過(guò)低均不利于黃色短桿菌生產(chǎn)L-Leu。

圖1 接種量對(duì)L-Leu發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of different inoculum size on L-Leu fermentation

2.2 生物素濃度對(duì)L-Leu生產(chǎn)菌的菌體生長(zhǎng)、耗糖及產(chǎn)量的影響

生物素作為酶的組成成分，參與機(jī)體的三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)——糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝，是生物體不可缺乏的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一。在白色鏈球菌發(fā)酵中期加入適量生物素，能顯著提高ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量[22]。微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸，生物素初始濃度對(duì)異檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶的轉(zhuǎn)錄水平及谷氨酸分泌影響很大[23]。限制培養(yǎng)基生物素濃度，?；鵆oA羧化酶活性降低，影響脂肪酸和分枝酸合成，細(xì)胞膜通透性增加，促進(jìn)C.glutamicum分泌L-谷氨酸[24]。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加20、50、80、120 μg/L生物素，每隔4 h測(cè)定菌體濃度、糖濃度、L-Leu濃度，結(jié)果如圖2。

A-菌體濃度；B-殘?zhí)呛?；C-L-Leu產(chǎn)量圖2 不同濃度生物素對(duì)L-Leu發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of different concentrations of biotin on L-Leu fermentation

當(dāng)生物素濃度提高，L-Leu生產(chǎn)菌能快速繁殖，較快進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期。隨著生物素濃度升高，菌體濃度也高。添加20、50、80、120 μg/L生物素，發(fā)酵液稀釋20倍，菌體濃度OD600分別能達(dá)到1.59、1.67、1.71、1.74。高濃度生物素使得糖代謝速率加快，加入120 μg/L生物素，16 h后發(fā)酵液殘?zhí)菨舛燃吹陀?0 g/L，加入20、50、80 μg/L生物素，發(fā)酵液殘?zhí)堑陀?0 g/L的時(shí)間相對(duì)滯后。生物素質(zhì)量濃度為20、50、80、120 μg/L，發(fā)酵終點(diǎn)L-Leu的質(zhì)量濃度分別為36、60、51、45 g/L。生物素濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和L-Leu的積累都有影響。生物素濃度過(guò)高或者過(guò)低，L-Leu的產(chǎn)量均低，這與谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)規(guī)律一致[11, 25]。

2.3 不同生物素濃度對(duì)L-Leu生產(chǎn)菌轉(zhuǎn)化率、副產(chǎn)物L(fēng)-Ala的影響

通過(guò)高效液相色譜測(cè)定了不同生物素濃度下，不同時(shí)間點(diǎn)的L-Leu及副產(chǎn)物L(fēng)-Ala的濃度，計(jì)算L-Leu的糖酸轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖3所示。發(fā)酵液中生物素質(zhì)量濃度為20、50、80、120 μg/L，轉(zhuǎn)化率分別為19%、22%、18%、15%，副產(chǎn)物L(fēng)-Ala的質(zhì)量濃度分別為7、8、11、15 g/L。添加高濃度的生物素，副產(chǎn)物L(fēng)-Ala隨之增加。當(dāng)生物素質(zhì)量濃度為50 μg/L時(shí)，糖酸轉(zhuǎn)化率最高，謝希賢等[26]通過(guò)定向選育得到L-Leu高產(chǎn)菌，糖酸轉(zhuǎn)化率相近。丙酮酸是分支鏈氨基酸的共同前體物，α-酮基異戊酸是L-纈氨酸的直接前體物，也是L-亮氨酸的間接前體物。此外，丙酮酸也可以與谷氨酸在谷-丙轉(zhuǎn)氨酶的作用下形成丙氨酸，此反應(yīng)過(guò)程是可逆的，且無(wú)反饋抑制效應(yīng)。添加較低濃度的生物素，副產(chǎn)物L(fēng)-Ala濃度也低，可能是低濃度的生物素使得丙酮酸生成丙氨酸的反應(yīng)減弱。

A-糖酸轉(zhuǎn)化率；B-L-Ala的生成量圖3 添加不同濃度生物素，對(duì)糖酸轉(zhuǎn)化率、副產(chǎn)物L(fēng)-Ala生成的影響Fig.3 Effect of adding different concentrations of biotin on the glucose conversion rate and the formation of by-product L-Ala, the glucose conversion rate and the yield of L-Ala

2.4 膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵研究

膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝，即在普通發(fā)酵的基礎(chǔ)上，將發(fā)酵罐與陶瓷膜相偶聯(lián)，發(fā)酵一定時(shí)間后，將發(fā)酵罐中的發(fā)酵液經(jīng)由陶瓷膜分離，將透析濾液排出，把濃縮菌體打回發(fā)酵罐，同時(shí)向發(fā)酵罐中補(bǔ)加透析培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵[27]。此工藝能有效解除胞內(nèi)產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用及有毒害副產(chǎn)物的抑制作用，促使產(chǎn)酸增加，產(chǎn)酸速率提高。戶紅通等[21]采用膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝，谷氨酸產(chǎn)量提高了94.6%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了3.5%。當(dāng)生物素添加量為50 μg/L時(shí)，L-Leu的產(chǎn)量最高，而副產(chǎn)物L(fēng)-Ala相對(duì)較高。為降低L-Leu后續(xù)處理難度，提高產(chǎn)品純度，采用膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定L-Leu與L-Ala產(chǎn)量及對(duì)比結(jié)果，如圖4所示。

A-普通發(fā)酵工藝; B-膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝圖4 普通發(fā)酵工藝與膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝L-Leu與L-Ala的產(chǎn)量Fig.4 Production of L-Leu and L-Ala by common fermen-tation process and membrane coupled intermittent dialysis fermentation process

普通發(fā)酵工藝，發(fā)酵終點(diǎn)L-Leu的產(chǎn)量為60 g/L，副產(chǎn)物L(fēng)-Ala的質(zhì)量濃度為8 g/L，且發(fā)酵36 h后L-Ala的生成速率增大。采用膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝，發(fā)酵36 h，L-Leu的產(chǎn)量為54 g/L，L-Ala的產(chǎn)量為1.8 g/L，膜過(guò)濾透析，補(bǔ)加透析培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵20 h，發(fā)酵終點(diǎn)L-Leu的產(chǎn)量為36 g/L，L-Ala的產(chǎn)量為2.3 g/L。此外，對(duì)2種發(fā)酵工藝的總產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)率進(jìn)行比較，結(jié)果如圖5。

A-糖酸轉(zhuǎn)化率、副產(chǎn)物、總產(chǎn)量;B-產(chǎn)率圖5 糖酸轉(zhuǎn)化率、副產(chǎn)物、總產(chǎn)量(A)及產(chǎn)率(B)的比較Fig.5 Comparison of glucose conversion rate, by-products, total production (A) and production rate (B)

普通發(fā)酵工藝，30 L發(fā)酵罐L-Leu的總產(chǎn)量約為1 200 g，糖酸轉(zhuǎn)化率為22%，而膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝L-Leu的總產(chǎn)量約為1 400 g，糖酸轉(zhuǎn)化率為25%，分別提升16.7%、13.6%。采用膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝，發(fā)酵36 h之前(透析前)，與普通發(fā)酵工藝的產(chǎn)率相近，其中26 h的產(chǎn)率最高，接近3 g/(L·h)，而36 h后，可以快速達(dá)到較高的產(chǎn)率。采用膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝，能降低發(fā)酵液L-Leu濃度，減輕其對(duì)L-Leu合成途徑關(guān)鍵酶的反饋抑制和反饋?zhàn)瓒簦コ擞泻Υx產(chǎn)物，提高了糖利用率，而且透析后進(jìn)一步提升了L-Leu的生產(chǎn)效率。通過(guò)透析處理降低了副產(chǎn)物L(fēng)-Ala的濃度，降低后續(xù)分離提純L-Leu的難度。

3 結(jié)論

本文以黃色短桿菌為研究對(duì)象，分析了培養(yǎng)基不同生物素的濃度對(duì)L-Leu發(fā)酵生產(chǎn)的影響。結(jié)果表明，生物素濃度高，菌體生長(zhǎng)快、菌體量大，生物素濃度過(guò)低，菌體生長(zhǎng)慢、菌體量少，不利于L-Leu的生成。通過(guò)控制生物素濃度，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜通透性[28]，使L-Leu非積累型細(xì)胞向L-Leu積累型細(xì)胞轉(zhuǎn)變。當(dāng)生物素濃度升高，副產(chǎn)物L(fēng)-Ala的濃度隨之升高，生物素濃度為120 μg/L，L-Ala濃度比生物素質(zhì)量濃度為50 μg/L時(shí)高87.5%。生物素添加量為50 μg/L時(shí)，L-Leu的產(chǎn)量為60 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為22%。在最適生物素濃度下，采用膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵，L-Leu的總產(chǎn)量較普通發(fā)酵工藝提高了16.7%，糖酸轉(zhuǎn)化率為25%，提高約13.6%。透析后可以使得產(chǎn)酸速率提高，有效降低了副產(chǎn)物L(fēng)-Ala濃度。本研究為工業(yè)化高產(chǎn)L-Leu發(fā)酵提供理論依據(jù)。