侯曉杰，梁魁景，于占晶

（衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北 衡水053000）

蘋果是我國主栽的經(jīng)濟(jì)作物之一。隨著蘋果種植面積的不斷擴(kuò)大，蘋果輪紋病的危害日益嚴(yán)重，我國山東、遼寧、河北等地區(qū)均有發(fā)生，極大地影響果品產(chǎn)量和質(zhì)量，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。蘋果輪紋病一旦發(fā)生，輕則削弱樹勢，重則導(dǎo)致枯枝、死樹。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國蘋果果園總體發(fā)病率在70%以上，一般年份蘋果產(chǎn)量損失20%～30%，多雨年份則達(dá)到40%～60%[1]。

目前對蘋果輪紋病的防治主要是化學(xué)防治。化學(xué)農(nóng)藥雖然有見效快、使用方便、可大規(guī)模應(yīng)用等優(yōu)點，但容易對環(huán)境造成污染和殘留在果品上，危害人類的健康。此外，化學(xué)藥劑的大量使用還會誘導(dǎo)病菌產(chǎn)生抗藥性。因此，采取一種高效、無毒、無污染的防治策略將成為研究防治蘋果輪紋病的重中之重[2]。生物防治是指利用拮抗性微生物而降低有害生物的作用，使其有益于有益生物[3]。拮抗微生物的拮抗機(jī)制主要通過生防細(xì)菌產(chǎn)生抗生素、 微生物之間的競爭作用及誘發(fā)植物自身的抗病性這3 種方式發(fā)揮拮抗植物病害的作用。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，利用熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluoreseus）防治小麥全蝕病[4]，利用枯草芽孢桿菌B-903 抑制蘋果輪紋病菌菌絲的擴(kuò)散[5]。生物防治無殘留、無污染，對人和牲畜都沒有傷害，且能夠不傷害天敵和有益生物，保護(hù)自然生態(tài)平衡。植物內(nèi)生菌作為一種天然生防菌，對于防治植物病害具有重要的意義[6]，有很大的開發(fā)應(yīng)用前景，是值得人們努力研究探索的一個方向。目前雖然國內(nèi)外對植物內(nèi)生菌的研究報道很多，但是利用微生物資源防治蘋果輪紋病的研究報道還很少。本文主要以蘋果的真菌病害為主要研究對象，利用對峙試驗的方法，從黃頂菊分離出來的花2、莖1、莖2、莖4 及從姜內(nèi)分離出的姜4，共5 種內(nèi)生細(xì)菌，從中篩選出對蘋果輪紋病具有廣譜拮抗能力的細(xì)菌，為開發(fā)綠色、高效、安全的新型微生物殺菌劑提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

5 種拮抗細(xì)菌如上述。蘋果輪紋病病菌由衡水學(xué)院生命科學(xué)系園林植物學(xué)實驗室提供。

1.1 5 種內(nèi)生細(xì)菌的活化

從冰箱中取出保存?zhèn)溆玫? 種內(nèi)生菌（莖1、莖2、莖4、花2、姜4），在無菌操作臺酒精燈周圍，將接種環(huán)放在酒精燈火焰上方灼燒至通紅，待其冷卻后將接種環(huán)深入細(xì)菌培養(yǎng)皿，輕輕挑取細(xì)菌劃線到新的NA 固體平板上培養(yǎng)，每種細(xì)菌重復(fù)3 次。接種后，將其放置到28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d。

1.2 蘋果輪紋病菌的復(fù)壯

首先需要對保存在低溫環(huán)境中的蘋果輪紋病菌進(jìn)行活化。在超凈工作臺上，首先用火柴點燃酒精燈，在酒精燈外焰上灼燒打孔器，待打孔器冷卻，在酒精燈周圍用打孔器在培養(yǎng)皿邊緣打出直徑為1 cm 的菌餅，然后將菌餅置入PDA 固體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿置于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，觀察病原菌的生長情況。

1.3 蘋果輪紋病病菌菌絲生長的抑制試驗

細(xì)菌菌懸液的制備： 在無菌操作臺上的酒精燈周圍，往培養(yǎng)好的細(xì)菌培養(yǎng)皿中注入適量無菌水，用玻璃棒輕輕刮取細(xì)菌，使其混在無菌水中，并用移液槍吸取，將其轉(zhuǎn)移至三角瓶中，密封。將三角瓶放置到振蕩器振蕩1 min，使細(xì)菌與水混合均勻。再用移液槍吸取振蕩好的菌懸液，滴入比色杯中，再將比色杯放入722分光光度計中，測定其OD 值，并不斷調(diào)整濃度，使其最終的OD 值為1.000。密封備用。

對峙培養(yǎng)：用酒精燈外焰灼燒打孔器滅菌，待打孔器冷卻后，在超凈工作臺上的酒精燈周圍，用直徑為1 cm 的打孔器在活化后的蘋果輪紋病培養(yǎng)基上打孔，挑取菌餅倒扣在新的PDA 平板上。在平板的外圍分別均勻放置3 個濾紙片，打開裝有菌懸液的三角瓶，用移液槍吸取制備好的細(xì)菌菌懸液50 μL，分3 次將其滴在濾紙片上，每種細(xì)菌重復(fù)3 次。同時用無菌水作對照。將所有的PDA 平板置于28 ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d。

1.4 抑菌圈直徑的測定

5 種內(nèi)生細(xì)菌與蘋果輪紋病病菌進(jìn)行對峙培養(yǎng)試驗，對蘋果輪紋病病菌進(jìn)行拮抗測定。測定蘋果輪紋病病菌菌落直徑，計算抑菌效果。

用Excel 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖，用Spss17.0進(jìn)行方差分析，差異顯著性水平位5%（p≤0.05）。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，5 種內(nèi)生細(xì)菌對蘋果輪紋病菌均有抑制作用，其中從黃頂菊花內(nèi)分離的花2 對病原菌的拮抗性最大，抑制效果最好；從姜內(nèi)分離的姜4 和從黃頂菊內(nèi)分離的莖2 次之； 抑制效果最差的則是從黃頂菊內(nèi)分離的莖1。平均抑菌率依次為55.026%、46.032%、44.444%、34.391%、26.455%前三者間差異不顯著，但顯著高于后二者；后二者間差異不顯著。

表1 5 種內(nèi)生細(xì)菌對蘋果輪紋病菌菌絲生長的抑制效果

3 小結(jié)與設(shè)想

植物病害的生物防治相較化學(xué)防治具有無與倫比的優(yōu)勢，已成為當(dāng)今研究的熱點。但植物內(nèi)生菌作為生防因子應(yīng)用的潛力還未完全開發(fā)出來，多數(shù)生防制劑的效果還不能令人滿意。本試驗研究表明，花2、莖2 和姜4 對蘋果輪紋病菌菌絲具有良好的拮抗作用，這為進(jìn)一步研究防治蘋果輪紋病的有效生物制劑奠定了基礎(chǔ)。今后要對蘋果輪紋病菌菌絲拮抗效果好的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生物學(xué)上的鑒定，同時分析黃頂菊和姜內(nèi)分離的內(nèi)生細(xì)菌起拮抗作用的成分，并研究其拮抗機(jī)理。