黃柯冰，趙 飛，陶維初，李鳳仙

阿爾茨海默?。ˋD）的早期癥狀為短期記憶喪失，隨著病情的惡化，語言、方向感、情緒、行動等能力喪失，生活無法自理，行動障礙[1]，最終導(dǎo)致死亡?；颊叽_診后的平均預(yù)期壽命為3～9年[2]，嚴重危害人體健康。AD的病理學(xué)特點為大腦皮層和特定的皮層區(qū)域中神經(jīng)元和突觸功能喪失，組織萎縮，如顳葉、頂葉、額葉皮層和扣帶回等腦區(qū)的退化[3]。七氟醚是一種吸入性的全身麻醉劑，具有帶甜味、不易燃、揮發(fā)性和起效快等特點[4]。電生理學(xué)研究顯示，七氟醚可作為γ-氨基丁酸受體的正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能[5]，也可作為天門冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑增強甘氨酸受體電流，并抑制乙酰膽堿和5-羥色胺受體電流[6]。雖然七氟醚具有神經(jīng)調(diào)節(jié)作用，但其對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及機制尚未闡明。因此，本課題主要研究七氟醚對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，并試圖探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 30只雄性C57BL/6小鼠[西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，SCXK(陜)2017-003]，體重（25±2）g。分籠飼養(yǎng)，每籠5只。動物房維持溫度（22±2）℃，濕度（54±2）%，12 h 光照與黑暗交替，自由飲食飲水。將小鼠隨機分為3組：對照組、模型組和七氟醚組，各10只。

1.2 AD小鼠模型的建立 參照石成男等[7]的方法建立AD小鼠模型：對模型組和七氟醚組腹腔注射 120 mg/(kg·d)D-半乳糖和 90 mg/(kg·d) 亞硝酸鹽，連續(xù)6 w；對照組給予同劑量的生理鹽水。

1.3 麻醉方法 七氟醚組在建模6 w后，采用自制麻醉箱（40 cm×15 cm×15 cm）進行七氟醚吸入麻醉。麻醉箱有2個側(cè)孔，一側(cè)接麻醉機，另一側(cè)接氣體監(jiān)測儀。調(diào)節(jié)揮發(fā)罐使箱內(nèi)七氟醚的濃度維持在3%，氧氣流量為 2 L/min，維持溫度為（37±1）℃，持續(xù)4 h。然后取出小鼠，在恢復(fù)正常反射后，放入原先的鼠籠中。對照組和模型組在相同條件下，在麻醉箱中吸入流量為2 L/min的氧氣。

1.4 Morris水迷宮實驗 各組分別于麻醉結(jié)束后1、2、3、4、5 和 6 d，進行水迷宮實驗，分為前 6 d 的定位航行實驗和第7 d的空間探索實驗。水迷宮為一個直徑180 cm、深60 cm的圓形黑金屬槽，槽內(nèi)注水，水深 40 cm，溫度（24±2）℃。 將攝像機安裝在槽上的天花板上，并與裝有分析管理系統(tǒng)的電腦相連。水迷宮被劃分為4個象限，在一個固定象限放置平臺，平臺沒于水下2 cm。定位航行實驗共訓(xùn)練4次，分別于4個入水點將小鼠面壁放入水中，記錄小鼠尋找并爬上平臺的時間，作為逃避潛伏期。如果小鼠在120 s還未達到平臺，則由實驗者將小鼠引至平臺，時間記為120 s，取4次訓(xùn)練的均值。第6 d的定位航行實驗結(jié)束后移除平臺，于第7 d進行空間探索實驗。將小鼠于移除平臺象限的斜對角象限的中點背向池壁放入水中，記錄小鼠在120 s內(nèi)于平臺象限中的滯留時間及穿越平臺位置的次數(shù)。平臺象限滯留時間比(%)=平臺象限滯留時間（s）/120（s）×100%。

1.5 實時定量PCR 水迷宮實驗結(jié)束后，小鼠斷頭處死，迅速分離腦組織，于冰塊上取海馬、前額葉皮層、杏仁核和小腦，儲存于-80℃?zhèn)溆谩Ｓ肨riZol試劑（美國Invitrogen公司）提取各腦區(qū)中的RNA，取1 μg RNA用TaqManTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA（美國 Invitrogen公司）,采用 SYBR GreenⅠ（美國Invitrogen公司）進行實時定量PCR擴增，GAPDH為內(nèi)參。引物由Primer Designing Tool在線軟件設(shè)計（表1）。采用實時定量PCR檢測GluR1、PSD95、GRP78、elF-2和PERK mRNA的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 各組逃避潛伏期比較 模型組的逃避潛伏期從訓(xùn)練第1 d開始長于對照組；訓(xùn)練第4 d前，七氟醚組的逃避潛伏期與模型組比較均無顯著差異（P>0.05），而從訓(xùn)練第4 d開始長于模型組（P<0.05，圖1）。提示七氟醚可加劇AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶損傷。

2.2 各組空間探索能力比較 與對照組相比，模型組平臺象限滯留時間和平臺象限滯留時間百分比降低，穿越平臺的次數(shù)均增加（P<0.05）；與模型組對比，七氟醚組的平臺象限滯留時間和平臺象限滯留時間比降低，穿越平臺的次數(shù)均增加（P<0.05）。提示七氟醚可加重AD小鼠的空間探索能力障礙。見表2。

表1 引物序列

圖1 比較各組逃避潛伏期（n=10）

2.3 各組各腦區(qū)GluR1和PSD95 mRNA的表達水平比較 除各組杏仁核PSD95的表達無顯著差異外，模型組GluR1和PSD95在各腦區(qū)中表達均低于對照組，而七氟醚組均低于模型組（P<0.05），提示七氟醚可促進AD小鼠大腦神經(jīng)元突觸功能障礙。見圖2。

2.4 各組各腦區(qū)GRP78、elF-2和PERK mRNA表達水平比較 模型組各腦區(qū)中GRP78、eIF-2和PERK的表達均高于對照組，而七氟醚組均高于模型組 （P<0.05），但七氟醚組杏仁核中eIF-2的表達、前額葉皮層和小腦中PERK的表達與模型組比較無顯著差異（P>0.05），提示七氟醚可促進AD小鼠各腦區(qū)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。見圖3。

3 討論

七氟醚是一種廣泛用于兒科麻醉的吸入麻醉藥，具有安全、起效快、恢復(fù)時間短等優(yōu)勢。但七氟醚可誘導(dǎo)嬰兒神經(jīng)元凋亡，并抑制新神經(jīng)元的產(chǎn)生[8]。研究表明，早期接觸七氟醚可能會呈劑量依賴式損害成年期的空間記憶，且4%的七氟醚引起的空間記憶損傷將可維持4 w[9]。七氟醚可誘導(dǎo)正常小鼠和孕鼠的神經(jīng)元凋亡，促進淀粉樣蛋白的聚集，進而參與AD的病理過程[10]。但也有相反的研究表明，接受七氟醚麻醉的年輕鼠和老年鼠的學(xué)習(xí)記憶功能均沒有損傷[11]。

逃避潛伏期反映受試動物的學(xué)習(xí)能力，潛伏期越短，其學(xué)習(xí)能力越強?？臻g探索能力反映的是受試動物的空間記憶的保持能力，受試動物在原平臺象限滯留時間越長，其記憶能力越強。本研究將AD小鼠暴露于3%的七氟醚中4 h后，采用水迷宮實驗檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及空間探索能力，發(fā)現(xiàn)七氟醚可進一步延長AD小鼠的逃避潛伏期，降低小鼠在平臺上的滯留時間。表明七氟醚可延長小鼠爬上平臺花費的時間，減少小鼠在平臺象限的滯留時間，即便在訓(xùn)練幾天后這種情況依然沒有改變，表示七氟醚加劇AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力損傷。

突觸蛋白的表達與突觸可塑性、突觸結(jié)構(gòu)的改變以及突觸傳遞有關(guān)。GluR1不僅是谷氨酸受體，還是陽離子通道，是許多突觸后膜上突觸可塑性和突觸傳遞的不可缺少的分子[12]。突觸后膜GluR1上調(diào)的潛在生理學(xué)機制與興奮性突觸后電位（EPSP）的增加有關(guān)，可導(dǎo)致EPSP持久增加，誘導(dǎo)長時程增強（LTP），增加學(xué)習(xí)記憶功能[12]。本研究表明，七氟醚可降低AD小鼠各腦區(qū)中GluR1的表達，可能是其損傷AD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用機制之一。PSD95是一個突觸后標記物，其下調(diào)可打亂突觸結(jié)構(gòu)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚降低AD小鼠海馬、前額葉皮層及小腦中PSD95的表達，提示七氟醚可能會破壞突觸結(jié)構(gòu)及突觸傳遞，損傷學(xué)習(xí)記憶功能。

表2 各組空間探索能力比較（n=10）

圖2 各組各腦區(qū)GluR1和PSD95 mRNA的表達水平比較

圖3 各組各腦區(qū)GRP78、elF-2和PERK mRNA表達水平比較

GRP78為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵生物標記分子，當(dāng)錯誤折疊的蛋白質(zhì)積累時，GRP78釋放，使跨膜信號蛋白聚集，并引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[15]。PERK為一個跨膜轉(zhuǎn)運信號分子，eIF-2為PERK通路上的關(guān)鍵分子[16]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可降低大鼠BDNF和突觸素的表達[17]，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對突觸功能的負向調(diào)控。研究表明，七氟醚可通過調(diào)控肌醇-1,4,5-三磷酸肌醇受體和魚尼丁受體將Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放至胞質(zhì)，可影響神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)[14]。然而，七氟醚是否可誘導(dǎo)AD小鼠神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還未可知。本研究顯示，七氟醚可增加AD小鼠各腦區(qū)中GRP78、eIF-2和PERK的表達，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能在七氟醚損傷AD小鼠學(xué)習(xí)記憶中起關(guān)鍵作用。由此可以推斷，七氟醚可誘導(dǎo)小鼠各腦區(qū)中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致突觸功能障礙，進一步損傷AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

總之，七氟醚可降低AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，其機制可能與影響小鼠各腦區(qū)突觸功能，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加有關(guān)。