王藝舟，潘啟華，王 乾，夏必琳，羅君志，方 健，鄧 羽，廖明聰，陳天圣，2

(1.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點實驗室，武漢 430070；2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德 415000)

Dazl(Deleted in Azoospermia-like)基因是DAZ基因家族的一員[1-3]，其編碼RRM(RNA recognition motif)RNA結合蛋白，是動物生殖細胞中非常重要的翻譯調(diào)控因子[4-5]。Dazl基因最早由Eberhart從蠅類睪丸組織中獲得，是一個性腺特異性表達的基因[3]。在成體動物睪丸組織中，Dazl主要分布于精原細胞和初級精母細胞的細胞核中，而在粗線期精母細胞中則主要分布在細胞質(zhì)中，這揭示了在減數(shù)分裂中Dazl完成了從精原細胞的細胞核向次級精母細胞的細胞質(zhì)內(nèi)遷移的過程[6]。Dazl表達的增加或下降顯著影響生物體的發(fā)育和生殖[7]，在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)中XDazl基因的缺失會導致原始生殖細胞的形成受到阻礙[8]；小鼠(Musmusculus)Dazl基因敲除后，發(fā)現(xiàn)雌性生殖細胞只能停滯在第一次減數(shù)分裂前期，而雄性生殖細胞在有絲分裂過程中就會受到影響，最終導致雌雄雙方都無法產(chǎn)生成熟配子[9]；在人類中，Dazl基因的缺失或突變會導致精子缺乏癥和男性不育[6]。

Dazl基因在魚類中的研究報道主要集中在斑馬魚(Daniorerio)[10]、青鳉(Oryziaslatipes)[11]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[12]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[13]、半滑舌鰨(Clariasgariepinus)[14]、亞洲鱸魚(Asianseabass)[15]、中華鱘(Acipensersinensis)[16]等，其研究內(nèi)容主要集中在RNA水平的表達和與原始生殖細胞的形成等關聯(lián)，Dazl蛋白只在青鳉、鯉魚、中華鱘等少數(shù)魚類中有報道[11，13，16]，但是魚類Dazl抗原保守性不高導致抗體不能跨物種使用。我們聚焦于青魚(Mylopharyngodonpiceus,Mp)的生殖細胞研究，青魚是我國傳統(tǒng)的“四大家魚”之一，2017年的中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒結果表明青魚總產(chǎn)量位于全國淡水魚產(chǎn)量的第8位[17]，其具有個體大、生長速度快、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點，但其繁殖周期較長，目前關于青魚的研究主要集中于人工繁殖[18]、養(yǎng)殖[19]、營養(yǎng)[20]、抗病[21]、資源分布[22]等方面，對于在生殖細胞c方面的相關研究少有報道。Dazl是許多生物中生殖細胞的形成和配子發(fā)生所必需的翻譯調(diào)控因子，是生殖細胞中特異表達的分子標記。本實驗室已經(jīng)在青魚卵巢中分離和鑒定Dazl基因，將其命名為MpDazl(GanBank: KY829471)，本研究在此基礎上開展青魚Dazl蛋白原核表達、抗體的制備以及抗體特異性的驗證，為下一步研究青魚生殖細胞的分離和標記奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌(Escherichiacoli)TOP 10和BL21購自北京全式金生物技術有限公司；載體pCS2、pET-28a、pT2BH-pr、pFastBac均為本實驗室保存或構建；青鳉肌肉細胞系(OLM)由本實驗室建立并保存；青魚購自武漢水產(chǎn)市場。

1.2 實驗方法

青魚Dazl原核表達載體的構建與鑒定 根據(jù)實驗室已獲得的pCS2-MpDazl質(zhì)粒和pET-28a載體的酶切位點分析結果，利用Primer 5軟件設計引物(Mp-Dazl-cds F 5′-AAAGCTAGCATGGTTTTAGATATGGATATCCAG-3′/ Mp-Dazl-cds R 5′- AAACTCGAGCAGAAGGGTTAGCAAAGTC-3′)。以pCS2-MpDazl為模板進行PCR擴增，利用DNA膠回收試劑盒(Omega，美國)回收純化PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物與pET-28a質(zhì)粒進行NheI和XhoI(NEB，美國)在37 ℃酶切后于進行回收于16 ℃連接。將連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌TOP 10后，挑取克隆后用質(zhì)粒提取試劑盒(Omega，美國)提取質(zhì)粒pET-28a-MpDazl，所提質(zhì)粒進行酶切鑒定并測序。

Dazl原核表達和表達條件優(yōu)化 將pET-28a-MpDazl轉化至BL21菌中，挑取陽性克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，再次接種至新鮮LB培養(yǎng)基中至OD600 mm為0.6～0.8時，利用IPTG誘導表達后，通過離心回收菌體，在菌體中加入20 μL蛋白上樣緩沖液(CW0052S，康為世紀)煮沸10 min，離心后取上層液體20 μL進行SDS-PAGE(康為世紀)電泳分析。表達條件優(yōu)化：(1)將已獲得的陽性菌液按照1%的濃度接種到LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)1 h，以終濃度為0.5 mmol/L和1 mmol/L的IPTG分別誘導3 h；(2)將已獲得的陽性菌液按照1‰的濃度接種到LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)1 h，以終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導，在25 ℃和37 ℃分別誘導2、3、4 h后取樣，以確定最佳誘導時間和溫度。

融合蛋白表達形式鑒定 將含有pET-28a-MpDazl重組質(zhì)粒的菌液離心并去上清，以1/10菌液體積的PBS重懸沉淀，冰浴中超聲波破碎菌體，超聲條件為功率400 W超聲5 s間隔10 s至菌液澄清，收集上清和沉淀，分別進行10% SDS-PAGE電泳分析。

融合蛋白抗體制備與效價檢測 將含有pET-28a-MpDazl菌體誘導蛋白，大量表達蛋白后取沉淀用尿素洗脫純化后[23-24]，將弗氏佐劑加入到純化好的蛋白中，選取2只健康的白兔將乳化好的產(chǎn)物分別進行背部多點皮下注射。第一次免疫7 d，后續(xù)每隔兩周加強免疫一次，4次免疫后取血分離血清。利用ELISA反應，測定抗體效價。武漢愛博泰克生物科技有限公司協(xié)助完成蛋白純化和免疫等工作。

多克隆抗體特異性檢測 取青魚的腦、眼、心、腎、肝、脾、卵巢各0.5 g，用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，檢測多克隆抗體是否特異識別青魚卵巢組織中的蛋白[23-24]。多克隆抗體檢測青鳉肌肉細胞系(OLM)表達的外源MpDazl蛋白，將已構建對照質(zhì)粒pT2BH-pr和表達外源MpDazl蛋白Dazl的pFastBac-MpDazl質(zhì)粒分別轉染OLM細胞中，檢測其中Dazl蛋白表達情況。轉染前將OLM細胞以1×106個/孔接種于六孔板中，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后用LipofectamineTM2000(Invitrogen，美國)進行轉染，每孔加6 μL轉染試劑及2 μg質(zhì)粒，48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。用蛋白抽提試劑盒提取不同轉染細胞蛋白，進行Western blot分析。

2 結果

2.1 青魚Dazl原核重組載體的構建與鑒定

以質(zhì)粒pCS2-MpDazl為模板擴增MpDazl編碼區(qū)(coding sequence, CDS)。將擴增出的MpDazlCDS 648 bp產(chǎn)物與pET-28a載體分別用NheI和XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接構建了原核表達載體pET-28a-MpDazl(圖1A、B)，原核表達載體pET-28a-MpDazl經(jīng)酶切后依次得到大小為5 543 bp和406 bp的片段，均與預期長度一致(圖1C)。將構建的載體送測序，確定插入片段準確無誤。

圖1 MpDazl原核表達載體構建

2.2 Dazl融合蛋白的表達和誘導條件優(yōu)化

將pET-28a-MpDazl載體轉入大腸桿菌中，其經(jīng)過IPTG誘導后通過SDS-PAGE電泳分析，結果表明有約27 kD的目的條帶。IPTG誘導濃度優(yōu)化結果顯示，在0.5 mmol/L和1 mmol/L的IPTG誘導條件下pET-28a-MpDazl融合蛋白表達量無明顯差異(圖2A)，因此選擇0.5 mmol/L IPTG濃度進行誘導表達。IPTG誘導時間和溫度優(yōu)化結果表明不同溫度無明顯差異，在誘導2、3、4 h后各融合蛋白均有一定的表達，其中在誘導4 h目的蛋白表達量最高，所以選擇4 h進行大量誘導(結果未顯示)。

圖2 His-Dazl融合蛋白表達的優(yōu)化

2.3 Dazl融合蛋白表達及純化

pET-28a-MpDazl菌體蛋白以上清和包涵體兩種形式存在，其主要分布在包涵體中(圖2B)。誘導pET-28a-MpDazl菌體蛋白大量表達后用尿素洗脫純化，通過蛋白電泳后采用軟件分析，灰度其純度達90%以上，能夠滿足后續(xù)抗體制備需求。

2.4 多克隆抗體特異性檢測及應用

所得青魚Dazl多克隆抗體效價為1∶256 000(表1)，可以進行抗原的特異性識別。抗體對不同濃度抗原的識別結果表明抗體能有效地檢測抗原(圖3A)。原核表達的蛋白提取液和表達內(nèi)源Dazl的組織蛋白提取物Western blot分析結果表明所制備多克隆抗體可特異識別菌體裂解液中目的蛋白(圖3B)；并且能特異識別青魚卵巢Dazl蛋白，這也證明Dazl蛋白具有性腺表達的特異性(圖3C)。此外，將pT2BH-pr和pFastBac-MpDazl質(zhì)粒分別轉染OLM細胞中均能檢測到紅色熒光(圖4A、B)。轉染后OLM細胞蛋白Western blot結果顯示，在轉染pFastBac-MpDazl的細胞后能檢測出表達的Dazl蛋白(圖4C)。通過以上結果說明制備的兔抗青魚Dazl多克隆抗體能夠有效識別原核表達的Dazl蛋白、內(nèi)源的Dazl蛋白和真核細胞過表達的Dazl蛋白，可用于后續(xù)研究中的Dazl蛋白檢測。

表1 ELISA檢測Dazl抗體效價

圖3 多克隆抗體特異性檢測

圖4 多克隆抗體應用于轉染細胞蛋白檢測

3 討論

本實驗采用原核表達系統(tǒng)，成功構建青魚Dazl基因的原核重組表達載體pET-28a-MpDazl，在大腸桿菌中獲得帶有組氨酸標簽的Dazl重組蛋白。為了有效地獲得重組蛋白，從IPTG濃度、溫度和誘導時間三個方面對表達條件進行優(yōu)化。結果表明，溫度與IPTG濃度無顯著性差異，誘導4 h后蛋白表達量最高?？紤]到高濃度的IPTG和大腸桿菌生長的最適溫度這兩個因素可能會影響大腸桿菌的生長，所以選擇37 ℃，0.5 mmol/L IPTG和誘導4 h為獲得His-Dazl重組蛋白的最佳條件。SDS-PAGE電泳結果表明，His-Dazl重組蛋白在菌體沉淀中表達最多，表明重組蛋白主要以包涵體的形式存在。我們在最適條件下大量表達了重組蛋白，并在蛋白變性的條件下用8 mol/L尿素純化。包涵體氫鍵在尿素的作用下有很強的可逆性變性作用，當尿素濃度8～10 mol/L時，包涵體的溶解度可達70%～90%。選用尿素溶解的優(yōu)點是它具有非離子化，呈中性，低成本等特點，而且復性后的蛋白不會導致大量蛋白質(zhì)沉淀[25]。以純化的蛋白作為抗原，免疫家兔制備His-Dazl多克隆抗體。ELISA分析結果表明，抗體效價高達256 000。His-Dazl抗體與原核表達的蛋白進行雜交，在約為27 KU處有一條明顯的單一條帶，說明制備的多克隆抗體能特異性識別重組蛋白；在青魚不同組織蛋白中只有在性腺中檢測到目的條帶，這說明其能特異性地識別青魚卵巢組織中的Dazl蛋白；我們還建立了過表達Dazl基因的魚類細胞系，在其中也檢測到目的條帶，結果表明其能識別外源c表達的Dazl蛋白。因此以上結果都說明制備的青魚Dazl抗體特異性好。

在斑馬魚[10]、青鳉[11]、鯉[13]、半滑舌鰨[14]、亞洲鱸[15]、中華鱘[16]、羅非魚[26]等物種中也陸續(xù)研究Dazl，Dazl的RNA或者蛋白都局限于性腺中表達，均能說明它是生殖細胞特異的分子標記。本研究使用制備的抗體檢測了Dazl蛋白在青魚不同成體組織中的表達情況，也證實了該蛋白在性腺中特異表達。該結果與之前Dazl蛋白在魚類和哺乳動物中所得到的研究結果類似，同時也暗示Dazl蛋白在青魚的性腺發(fā)育和分化中起著重要的調(diào)控作用，為后期研究Dazl蛋白在青魚生殖細胞中的應用奠定基礎。