楊長庚，文 華，王美姿，陸 星，蔣 明，田 娟，喻麗娟

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢430223；2.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江 524048)

環(huán)境因子例如溫度、光照、鹽度、溶解氧等能夠制約魚類的生長繁殖[1]。其中，溫度對魚類生長發(fā)育的影響尤為明顯。針對溫度對魚類生理影響的研究從魚類的形態(tài)、生理、生化到分子等各個(gè)方面均有研究[2-5]。

羅非魚(Oreochromisniloticus， tilapia)，原產(chǎn)于非洲，屬鱸形目麗魚科羅非魚屬，為溫水魚類，其生長溫度范圍為16～38 ℃，適溫范圍22～35 ℃，耐低溫能力較差[6]，是僅次于鯉科和鮭科魚類的世界第三大養(yǎng)殖品種，在熱帶和亞熱帶地區(qū)具有廣泛的養(yǎng)殖[7]。目前，中國已成為世界最大的羅非魚養(yǎng)殖國家。然而，受其耐低溫能力差的影響，我國羅非魚的養(yǎng)殖受到氣候與溫度的制約，導(dǎo)致了其南北地理位置分布極不均衡。因此，如何提高羅非魚耐低溫能力已成為其增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展所面臨的重要問題之一。目前，已有一些關(guān)于低溫對羅非魚的影響以及羅非魚耐低溫性能的研究[8-9]。而針對羅非魚的影響，前期，我們從低溫脅迫羅非魚的數(shù)字基因表達(dá)譜中篩選到一個(gè)受低溫脅迫影響的基因-生長抑制特異性基因2(growth arrest specific 2 gene， Gas2)[10]。Gas2是微絲系統(tǒng)的組成成分，在進(jìn)化過程中高度保守，主要起著在凋亡過程中調(diào)節(jié)微絲和細(xì)胞形態(tài)變化作用[11-12]。此外，P53基因能與細(xì)胞骨架相互作用[13-14]，P53基因又是一種腫瘤抑制基因，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由此，本研究利用Gas2基因的shRNA(short hairpin RNA)轉(zhuǎn)染羅非魚腎臟細(xì)胞系，并對轉(zhuǎn)染后的羅非魚腎臟細(xì)胞進(jìn)行低溫脅迫，通過檢測Gas2基因及P53 mRNA的表達(dá)變化、以及低溫脅迫下細(xì)胞的增殖及凋亡情況，從而進(jìn)一步認(rèn)識TLGas2(Tilapia Gas2)基因的功能，加深我們對羅非魚在低溫脅迫下的響應(yīng)機(jī)制的理解，為培育耐低溫羅非魚以及研制抗低溫基因產(chǎn)品等提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

羅非魚腎臟細(xì)胞系(SKC)(長江水產(chǎn)研究所保藏，中國)；pGPU6/ GFP/Neo-gas2 shRNA 載體(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，中國)；MEM 培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司，美國)，LipofectaminTM 2000試劑盒(Invitrogen公司，美國)；WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，中國)，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，中國)；TRIzolReagent (Invitrogen 公司，美國)；FastKing RT Kit (With gDNase)(天根生化科技(北京)有限公司，中國)；FastFire qPCR PreMix (SYBR Green)(天根生化科技(北京)有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 short hairpin RNA (shRNA)表達(dá)載體選擇

根據(jù)Gas2基因序列設(shè)計(jì)三條shRNA序列。委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司使用pGPU6/Neo載體構(gòu)建shRNA表達(dá)質(zhì)粒(shG1， shG2， and shG3)。根據(jù)前期轉(zhuǎn)染羅非魚腎臟細(xì)胞系檢測干擾效率，篩選出shG3載體[15]。shRNA序列如下：5′ GATCCAAAAAAGCCAATGATCCACCTTGCAGATCTCTTGA

ATCTGCAAGGTGGATCATTGGC 3′。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及低溫脅迫

將羅非魚腎臟細(xì)胞(TKC)常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中25 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)TKC細(xì)胞至對數(shù)生長期，調(diào)整細(xì)胞密度，分別接種于6孔板(用于提取mRNA)，24孔板(用于細(xì)胞凋亡檢測)或96孔板(用于細(xì)胞增殖檢測)中。當(dāng)融合度為80%左右時(shí)按LipofectaminTM 2000試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在25 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置陰性對照組(Nc)及Gas2干擾組(RNAI)，分別轉(zhuǎn)染shNc對照質(zhì)粒和shG3干擾質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h后，按照5 ℃/d的降溫速率，將培養(yǎng)溫度降至10 ℃。分別在25 ℃，20 ℃，15 ℃，10 ℃檢測Gas2基因和P53基因mRNA表達(dá)以及細(xì)胞增殖、凋亡情況。

1.2.3 總RNA提取、cDNA合成

分別在不同處理溫度下將6孔板中細(xì)胞去其上清，用PBS洗兩次后，每孔加TRIZOL試劑1 mL，消化5～10 min。小心吸取上清轉(zhuǎn)入新的EP 管，加入氯仿200 μL，混勻至乳白色，冰上靜置5 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，小心吸取上清轉(zhuǎn)入新的EP 管，加入異丙醇500 μL，上下顛倒搖勻，冰上靜置10 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，棄上清，向沉淀中加入75%乙醇1 mL，4 ℃，10 000 r/min離心5 min，棄上清，適當(dāng)干燥，加入適量DEPC 水溶解，電泳檢測后-80 ℃保存?zhèn)溆?。分別以提取的總RNA 500 ng為模板，參照FastKing RT Kit (With gDNase)第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

參照FastFire qPCR PreMix (SYBR Green)熒光定量預(yù)混試劑盒說明書，使用QuantStudio6 Flex系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以18S RNA作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品設(shè)定3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，正、反向引物(10 μmol/L) 各0.6 μL，cDNA 模板2 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，60 ℃ 32 s，72 ℃ 32 s，40 個(gè)循環(huán)。相對定量分析采用2-Δ ΔCt的方法。

1.2.5 細(xì)胞增殖及凋亡檢測

按照WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書，孵育2 h后，分別對不同溫度處理下細(xì)胞樣品，每個(gè)樣品設(shè)定3個(gè)重復(fù)，利用酶標(biāo)儀BioTek Synergy2在450 nm測定吸光度。

按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，室溫(20～25 ℃)避光孵育20分鐘，分別對不同溫度處理下細(xì)胞樣品，利用流式細(xì)胞儀(Beckman CytoFLEX FCM)檢測細(xì)胞凋亡，計(jì)算凋亡比率。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 18.0軟件中的單因素方差(One-way ANOVA)分析，分析各組數(shù)據(jù)的差異顯著與否，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Gas2及P53基因的mRNA表達(dá)情況

如圖1所示，低溫脅迫下，RNAI組與Nc組中Gas2、P53基因mRNA表達(dá)與25 ℃相比在15 ℃和10 ℃時(shí)均顯著升高。而RNAI組中P53基因mRNA的表達(dá)在20 ℃時(shí)與25 ℃相比變化不明顯。Nc組中Gas2、P53基因mRNA表達(dá)在20 ℃時(shí)與25 ℃相比均顯著升高。

在同一溫度下時(shí)，RNAI組Gas2、P53基因mRNA表達(dá)均顯著低與Nc組。

圖1 干擾Gas2基因的羅非魚腎臟細(xì)胞受低溫脅迫時(shí)Gas2、P53基因mRNA表達(dá)變化情況

2.2 低溫脅迫下抑制Gas2基因后細(xì)胞凋亡情況

隨溫度降低，RNAI組及Nc組的羅非魚腎臟細(xì)胞凋亡率均明顯升高。但是同時(shí)隨著溫度降低，與對照相比，RNAI組細(xì)胞凋亡率明顯低于Nc組。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測低溫脅迫下羅非魚腎臟細(xì)胞細(xì)胞凋亡情況

2.3 低溫脅迫下抑制Gas2基因后細(xì)胞增殖情況

圖3所示，隨溫度降低，RNAI組及Nc組的羅非魚腎臟細(xì)胞增殖率均顯著降低。在25 ℃及20 ℃時(shí)，RNAI組的細(xì)胞增殖率顯著低于Nc組，而在15 ℃時(shí)，RNAI組的細(xì)胞增殖率顯著高于Nc組。

圖3 低溫脅迫下羅非魚腎臟細(xì)胞在不同溫度下的增殖情況

3 討論

溫度尤其是低溫與生物體組織器官發(fā)育、機(jī)體正常生理活動維持、免疫抑制等生理過程有密切關(guān)系[9， 16-17]。低溫會造成魚類從生理生化到分子遺傳等多個(gè)方面的變化。例如：Carginale等[7]研究發(fā)現(xiàn)，南極巖石鱈魚通過兩種不同策略實(shí)現(xiàn)低溫下高效消化食物蛋白質(zhì)來適應(yīng)低溫環(huán)境：一是通過基因復(fù)制，提高酶產(chǎn)量以彌補(bǔ)在冷脅迫下轉(zhuǎn)錄效率的降低；另一個(gè)是通過表達(dá)一類在低溫下特異表達(dá)的低溫胃蛋白酶來提高食物的消化效率。Yao 等[18]2012 年對貽貝Mytilus edulis的研究結(jié)果表明，在貽貝中低溫脅迫與高溫應(yīng)激均依賴caspase-3，并提出在高溫以及低溫下的DNA 損傷與之后的應(yīng)激反應(yīng)(例如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡)之間存在必然的因果聯(lián)系。在細(xì)胞水平上，低溫脅迫可以導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、膜破損，造成細(xì)胞壞死[19]，而且還能引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列復(fù)雜的基因表達(dá)變化和生理反應(yīng)，抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期發(fā)生改變，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20-21]。細(xì)胞水平的影響主要包括低溫影響細(xì)胞膜流動性，物質(zhì)運(yùn)輸，導(dǎo)致細(xì)胞停止分裂生長，并進(jìn)入凋亡階段[22-23]。此外， 嚴(yán)文靜等[24]研究短蓋巨脂鯉Piaractus brachypomus發(fā)現(xiàn)， 低溫導(dǎo)致一些魚類細(xì)胞致死的途徑是細(xì)胞凋亡。而這一系列影響，是建立在分子水平影響上的。因此，從細(xì)胞凋亡相關(guān)基因入手研究低溫脅迫對魚類的影響是很有必要的。然而，低溫對羅非魚組織細(xì)胞學(xué)方面的研究資料較少。

生長抑制特異性基因2(growth arrest specific 2 gene，Gas2)，是微絲系統(tǒng)的組成成分，主要起著調(diào)節(jié)微絲和細(xì)胞形態(tài)變化作用[11， 25]。同時(shí)，Gas2基因又是一個(gè)多功能的基因，參與著細(xì)胞的凋亡過程，一方面作為凋亡的效應(yīng)分子，是caspase-3的底物，被caspase-3酶切，參與凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變[12， 26]；另一方面，過表達(dá)的Gas2不直接引起細(xì)胞的凋亡，但是可以增加細(xì)胞對凋亡信號的敏感性[27]。我們的研究中，隨溫度降低，RNAI組及Nc組的羅非魚腎臟細(xì)胞凋亡率均明顯升高。并且在溫度降至20 ℃以下細(xì)胞明顯受到低溫脅迫時(shí)，抑制了Gas2基因的羅非魚腎臟細(xì)胞凋亡率與對照相比明顯下降。說明低溫不僅可以引起細(xì)胞的壞死，同時(shí)也能引起細(xì)胞凋亡。同時(shí)Gas2基因參與了細(xì)胞周期過程，在其中起到一定的作用，能夠引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生。隨溫度降低，RNAI組及Nc組的羅非魚腎臟細(xì)胞增值率均顯著下降，也說明了低溫對正常細(xì)胞周期的負(fù)面影響。如圖3所示，Gas2干擾組與陰性對照組的羅非魚腎臟細(xì)胞的增殖水平在低溫脅迫下均顯著降低，但Gas2干擾組的下降趨勢與陰性對照組相比更為平緩，尤其在20～15 ℃區(qū)間的增殖水平降低較少。并且，在溫度降至20 ℃以下細(xì)胞明顯受到低溫脅迫時(shí)，抑制了Gas2基因后的羅非魚腎臟細(xì)胞其增殖率顯著高于對照組，更說明Gas2基因?qū)?xì)胞凋亡的調(diào)控作用，抑制Gas2基因后可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

已有研究發(fā)現(xiàn)Gas2在體內(nèi)與m鈣蛋白酶結(jié)合，抑制m鈣蛋白酶的活性，從而使P53穩(wěn)定性增加[27]。而P53基因是一種腫瘤抑制基因，其控制著細(xì)胞周期的啟動，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們的研究中，P53基因的表達(dá)也隨著Gas2基因的表達(dá)發(fā)生變化。這可能是因?yàn)镻53基因能與細(xì)胞骨架有相互作用[13-14]，而Gas2基因是微絲系統(tǒng)的組成成分，抑制Gas2基因后，同時(shí)也引起了P53基因的表達(dá)變化，降低P53基因表達(dá)，從而進(jìn)一步影響細(xì)胞凋亡。

Gas2基因能夠影響P53基因表達(dá)，在羅非魚細(xì)胞凋亡過程中具有一定作用。抑制Gas2基因后，羅非魚腎臟細(xì)胞在受低溫脅迫時(shí)，能夠降低細(xì)胞的凋亡率，增加細(xì)胞的增殖。