吳麗娜 朱峰 徐鋮 葉恩如

大腸癌是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥類型之一，中國 每年有200萬新診斷病例。近年來，雖然在衛(wèi)生保健和篩查手段方面有所改進(jìn)，但是大腸癌相關(guān)死亡的新病例數(shù)量卻在逐年增加[1-2]。大腸癌的高發(fā)病率和高死亡率提示，研究其發(fā)病機(jī)制對于改善大腸癌治療現(xiàn)狀具有重要的臨床意義。脂肪非典型鈣黏蛋白4（fat atypical cadherin，F(xiàn)AT4）屬于鈣黏蛋白超家族成員之一，作為跨膜蛋白受體可以將上游Hippo信號通路的細(xì)胞外信號傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)。研究證實FAT4對惡性腫瘤有抑制作用，F(xiàn)AT4基因失活可能與啟動子的甲基化有關(guān)[3]，外周血白細(xì)胞FAT4異常甲基化和基因-環(huán)境相互作用與胃癌的風(fēng)險相關(guān)[4]。Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）是Hippo信號通路的關(guān)鍵組成部分，在人體生長、發(fā)育、修復(fù)和體內(nèi)平衡中起重要作用[5-6]。越來越多的證據(jù)表明YAP在胃癌[7]、乳腺癌[8]等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。本研究采用免疫組化En Vision法檢測FAT4和YAP在大腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況，分析大腸癌組織中FAT4和YAP的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，旨在探討FAT4和YAP的表達(dá)是否參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程及對預(yù)后的影響。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2012年1月至2014年12月在本院行手術(shù)切除的大腸癌標(biāo)本80例，術(shù)后均經(jīng)病理明確診斷，術(shù)前均未接受放療、化療及生物治療。80例患者中男 45 例，女 35 例；年齡 31～79（61.46±10.25）歲；腫瘤直徑≥5.0cm 31例，＜5.0cm 49例；組織學(xué)分級：高中分化55例，低分化25例；浸潤深度：未侵及漿膜30例，侵及漿膜50例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無轉(zhuǎn)移44例；參照2010年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會修訂的TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期48例。同時以癌旁（距腫瘤原發(fā)灶＞5cm）組織作對照，病理檢查證實均為正常大腸組織。

1.2 主要試劑 兔抗人FAT4多克隆抗體購自美國Novus Biologicals公司，鼠抗人YAP單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，En Vision通用試劑盒和DAB顯色劑均購自丹麥Dako公司。

1.3 檢測方法大腸癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本離體后立即用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋。采用免疫組化En Vision法進(jìn)行染色，嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行操作。高壓鍋及檸檬酸修復(fù)液（pH 6.0）抗原修復(fù)，正常山羊血清封閉30min，一抗4℃過夜，二抗孵育30min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。用已知陽性片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 FAT4和YAP染色陽性信號為出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒，F(xiàn)AT4定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，YAP定位于細(xì)胞核。選取5個以上高倍視野（×400），觀察并記錄每張切片的染色強(qiáng)度和面積，通過半定量積分法進(jìn)行判定。染色強(qiáng)度：無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞數(shù)百分比：陽性細(xì)胞數(shù)百分比≤5%為0分，6%～10%為1分，11%～50%為2分，＞50%為3分。細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比計分的乘積為每例的最終積分。＜2分為陰性，≥2分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以 表示；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman等級相關(guān)分析FAT4和YAP表達(dá)的相關(guān)性。采用Kaplan-Menier法計算生存率，以log-rank法比較組間生存率的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸癌組織和癌旁正常組織中FAT4和YAP的表達(dá) FAT4陽性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒，YAP陽性表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒，見圖1。大腸癌組織中FAT4陽性表達(dá)率為32.50%（26/80），明顯低于癌旁正常組織的66.25%（53/80），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.227，P＜0.01）。大腸癌組織中YAP陽性表達(dá)率為61.25%（49/80），明顯高于癌旁正常組織的13.75%（11/80），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=38.506，P＜0.01）。

圖1 大腸癌組織和癌旁正常組織中FAT4和YAP的表達(dá)（a：FAT4在大腸癌組織中陽性表達(dá)；b：FAT4在癌旁正常組織中陽性表達(dá)；c：YAP在大腸癌組織中陽性表達(dá)；d：YAP在癌旁正常組織中陰性表達(dá)；En Vision染色，×400）

2.2 大腸癌組織中FAT4和YAP表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 FAT4陽性表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期均有關(guān)（均P＜0.01），而與患者性別、年齡、腫瘤直徑和分化程度均無關(guān)（均P＞0.05）。YAP陽性表達(dá)與腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)（均P＜0.01），而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度和TNM分期均無關(guān)（均P＞0.05），見表1。

表1 大腸癌組織中FAT4和YAP表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 大腸癌組織中FAT4和YAP表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，大腸癌組織中FAT4的表達(dá)和YAP 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.434，P＜0.01），見表 2。

表2 80例大腸癌組織中FAT4和YAP表達(dá)的相關(guān)性（例）

2.4 大腸癌組織中FAT4和YAP的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 80例大腸癌患者均采用電話隨訪3年，存活48例，死亡32例。FAT4表達(dá)陽性者3年生存率為84.62%，明顯高于FAT4表達(dá)陰性者的48.15%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.720，P＜0.01）；YAP表達(dá)陽性者 3年生存率為44.89%，明顯低于YAP表達(dá)陰性者的83.87%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.020，P＜0.01）。

3 討論

許多發(fā)育基因參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的調(diào)控失衡。FAT基因家族是鈣黏蛋白超家族的成員，在果蠅發(fā)育過程中調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞極性[9]。FAT家族包含F(xiàn)AT1、FAT2、FAT3和FAT4 4個成員。FAT4基因編碼超過5 000個氨基酸的巨大跨膜蛋白。該基因是Hippo信號通路的成員，在調(diào)節(jié)器官大小方面具有重要作用。該信號通路的下游部分可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄共激活因子[YAP/具有PDZ結(jié)合基序（TAZ）]調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，逃避細(xì)胞凋亡。此外，F(xiàn)AT4在多種腫瘤中低表達(dá)，是腫瘤的抑制基因[10-12]。與正常對照組織比較，胃腺癌組織中FAT4表達(dá)減少。FAT4表達(dá)下調(diào)與腫瘤分級有關(guān)，晚期分級中有較高的抑制作用。FAT4表達(dá)降低及其啟動子甲基化增加可能是將正常的胃組織轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤組織的有效過程之一[13]。本研究顯示，大腸癌組織中FAT4陽性表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織，且FAT4陽性表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期均有關(guān)。生存分析顯示，F(xiàn)AT4表達(dá)陽性者3年生存率明顯高于FAT4表達(dá)陰性者，提示FAT4表達(dá)陰性者預(yù)后差。表明FAT4蛋白表達(dá)下降可能在大腸癌的發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移過程中起作用，進(jìn)一步提示FAT4是大腸癌的抑制基因，與上述研究結(jié)果類似。

YAP是Hippo信號通路的核心效應(yīng)因子，在調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡及組織器官大小方面起著重要作用。YAP進(jìn)入細(xì)胞核后作為轉(zhuǎn)錄共激活因子與TEA域家族成員1（TEAD1）結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因表達(dá)，進(jìn)而在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及癌變過程中起作用[14]。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌（HCC）組織中，YAP表達(dá)明顯增加，并且其過表達(dá)與腫瘤分化程度相關(guān)。通過小干擾RNA沉默YAP導(dǎo)致HCC細(xì)胞生長的抑制，這與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。YAP的沉默還降低了HCC細(xì)胞的侵襲潛力，增加了HCC細(xì)胞對順鉑的化學(xué)敏感性。總之，這些結(jié)果表明YAP在HCC中過表達(dá)，并促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和耐藥性。本研究顯示，大腸癌組織中YAP陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，且YAP陽性表達(dá)與腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)。生存分析顯示，YAP表達(dá)陽性者3年生存率明顯低于YAP表達(dá)陰性者，提示YAP表達(dá)陽性者預(yù)后差。

在胃癌細(xì)胞中采用短發(fā)夾狀RNA沉默F(xiàn)AT4，發(fā)現(xiàn)FAT4抑制導(dǎo)致YAP的磷酸化和YAP核積聚增加，這與促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)。進(jìn)一步將全長FAT4轉(zhuǎn)染到FAT4沉默細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)YAP磷酸化的減少和細(xì)胞周期進(jìn)程的抑制[16]。表明胃癌組織FAT4表達(dá)下降，可以抑制YAP的磷酸化和促進(jìn)YAP進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致YAP在細(xì)胞核中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而參與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。FAT4和YAP在大腸癌的相互作用如何，目前還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中FAT4的表達(dá)和YAP的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示FAT4和YAP是一對拮抗因素，F(xiàn)AT4可能通過上調(diào)YAP的表達(dá)，參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展，這與上述胃癌中的研究結(jié)果一致。

綜上所述，大腸癌組織中FAT4表達(dá)降低，而YAP表達(dá)升高，其異常表達(dá)均與大腸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)。FAT4的表達(dá)和YAP的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)AT4表達(dá)陽性者較陰性者預(yù)后好，而YAP表達(dá)陽性者較陰性者預(yù)后差，兩者異常表達(dá)可能與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。FAT4和YAP在大腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中如何調(diào)控及調(diào)控的具體機(jī)制如何需要從細(xì)胞培養(yǎng)及體外實驗進(jìn)一步闡明。