王亞飛 李苗云 崔文明 趙改名 柳艷霞 高曉平

（1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州450002 2 中檢集團(tuán)中原農(nóng)食產(chǎn)品檢測(cè)（河南）有限公司 鄭州450002）

甲型副傷寒沙門(mén)氏菌是一種無(wú)莢膜的革蘭氏陰性桿菌，能夠引起傷寒癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，傷寒癥導(dǎo)致每年217 000 人死亡，其中中南亞和東南亞是主要的疾病暴發(fā)地。已報(bào)道的幾乎80%傷寒病例來(lái)自于8 個(gè)南亞國(guó)家（孟加拉國(guó)、中國(guó)、印度、印度尼西亞、老撾、尼泊爾、巴基斯坦和越南），發(fā)病以兒童，青少年較多[1]。目前，傷寒腸熱病仍是全球的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，尤其是在亞洲。食品中殺菌的方法很多，包括物理、化學(xué)和生物等。熱處理是商業(yè)應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)方法，它是食品工業(yè)最經(jīng)濟(jì)、最簡(jiǎn)便和使用最廣泛的殺菌方法。為了減少高溫對(duì)肉制品的風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)成分的破壞，許多肉制品加工都采用巴氏殺菌的方法來(lái)減少細(xì)菌病原體[2-3]。然而，肉類產(chǎn)品的物理和化學(xué)特性都可以影響熱加工對(duì)微生物的殺傷力，因此研究甲型副傷寒沙門(mén)氏菌在肉制品加工過(guò)程中熱響應(yīng)特性機(jī)理是必要的。

σ 因子是原核生物生命活動(dòng)中的重要調(diào)節(jié)因子，尤其在響應(yīng)各種不同環(huán)境應(yīng)激時(shí)發(fā)揮重要作用[4]。RpoE 調(diào)節(jié)因子是由rpoE 基因編碼，是腸桿菌科中重要的σ 因子[5]。目前rpoE 基因功能研究主要集中于大腸桿菌，功能集中以下方面：溫度脅迫、營(yíng)養(yǎng)脅迫、高滲脅迫、氧化脅迫、其它脅迫和致病過(guò)程。而對(duì)rpoE 在鼠傷寒沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌的作用也有初步研究，rpoE 對(duì)甲型副傷寒沙門(mén)氏菌在肉制品加工過(guò)程的復(fù)雜的環(huán)境條件下的作用尚不清楚。

要確定rpoE 基因功能，需使該基因在甲型副傷寒沙門(mén)氏菌中缺失，然后比較缺陷株和野生株的差異，來(lái)確定其在肉制品加工過(guò)程的復(fù)雜環(huán)境下的功能。本研究用缺陷株是前期試驗(yàn)中利用Red 同源重組技術(shù)對(duì)甲型副傷寒沙門(mén)氏菌rpoE基因敲除獲得的。

為研究甲型副傷寒沙門(mén)氏菌rpoE 作為σ 因子在肉制品加工過(guò)程的復(fù)雜外界環(huán)境下的作用，首先通過(guò)PCR 檢驗(yàn)△rpoE 缺陷株缺陷并穩(wěn)定表達(dá)，然后比較缺陷株和野生株在肉制品加工條件下的致死情況，并在接近加工的不同溫度下重復(fù)試驗(yàn)，明確rpoE 對(duì)甲型副傷寒的影響，進(jìn)一步研究甲型副傷寒沙門(mén)氏菌在不同環(huán)境下的應(yīng)激反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株 試驗(yàn)所用甲型副傷寒沙門(mén)氏菌是從肉中分離的經(jīng)過(guò)國(guó)標(biāo)法生化鑒定、Vitek 測(cè)定以及測(cè)序鑒定的。缺陷株△rpoE 是前期試驗(yàn)利用此株甲型副傷寒通過(guò)Red 同源重組構(gòu)建的。

1.1.2 試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯 （Nutrient Broth，NB），青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；木糖賴氨酸脫氧 膽 鹽 （Xylose Lysine deoxycholate Salt Agar，XLD）瓊脂，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉（分析純），天津市瑞金特化學(xué)有限公司；Ezup 柱式基因組DNA 抽提試劑盒（細(xì)菌），上海生物工程有限公司；引物由上海生物工程有限公司合成。

1.1.3 儀器與設(shè)備 HVE-50 高壓蒸汽滅菌鍋，日本HIRAYAMA 公司；SPX-1505H-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械公司；SW-CJ-2F 超級(jí)工作臺(tái)，蘇州安泰空氣計(jì)數(shù)有限公司；THZ-C 臺(tái)式恒溫振蕩器，太倉(cāng)市華美生化儀器廠；EasyMix 均質(zhì)機(jī)，法國(guó)AES 公司；THZ-82 水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 缺陷株△rpoE 鑒定 試驗(yàn)所用甲型副傷寒沙門(mén)氏菌是從肉中分離的經(jīng)過(guò)國(guó)標(biāo)法生化鑒定、Vitek 測(cè)定以及測(cè)序鑒定的。缺陷株△rpoE 是前期試驗(yàn)利用此株甲型副傷寒通過(guò)Red 同源重組構(gòu)建的。將野生株和缺陷株從冰箱里取出，復(fù)蘇，分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）中，置于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，檢查生長(zhǎng)情況。采用Ezup 柱式基因組DNA 抽提試劑盒（細(xì)菌）提取野生株和缺陷株的基因組DNA。根據(jù)NCBI 沙門(mén)氏菌rpoE 基因序列用Primer Premier 5.0 軟 件 設(shè) 計(jì) 引 物 F：GAATCGCGGATCAGGT，R：TGCGGCTTATGGAGTG，缺陷株和野生株在繁殖10 代后進(jìn)行PCR 鑒定，所擴(kuò)增片段大小分別為1 261，795 bp，對(duì)比野生株和缺陷株P(guān)CR 產(chǎn)物，確定缺陷株穩(wěn)定性。

1.2.2 野生株和缺陷株在最適溫度37 ℃條件下的生長(zhǎng)能力 分別挑取野生株和缺陷株單菌落，接種于NB 液體培養(yǎng)基中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。然后按1∶100 比例接入新鮮NB 液體培養(yǎng)基中，調(diào)整OD600值相等后37 ℃培養(yǎng)，每隔2 h 采用涂布法測(cè)定菌落數(shù)，考察野生株和缺陷株的生長(zhǎng)能力。

1.2.3 甲型副傷寒沙門(mén)氏菌野生株和缺陷株在介質(zhì)中的熱處理 挑取野生株和缺陷株甲型副傷寒沙門(mén)氏菌單菌落，分別接種于100 mL NB 液體培養(yǎng)基中37 ℃搖床培養(yǎng)16 h，達(dá)到穩(wěn)定期。用純瘦肉灌腸作為介質(zhì)，采用注射法進(jìn)行人工污染，人工污染的菌液濃度為108CFU/mL，樣品攪碎稱取25 g 注射2.5 mL 菌液[6]，放入真空袋中壓成片狀，用真空包裝機(jī)抽真空，并封口，37 ℃培養(yǎng)16 h。水浴鍋溫度設(shè)為55，63，72 ℃，加熱時(shí)間從0～180 min不等。加熱時(shí)，將樣品完全浸沒(méi)熱水中，按照預(yù)先設(shè)定的時(shí)間間隔，定時(shí)取出樣品進(jìn)行測(cè)定。熱處理后的樣品應(yīng)立即放入預(yù)先準(zhǔn)備好的冰水中阻止其繼續(xù)進(jìn)行熱失活過(guò)程。從設(shè)定的溫度冷卻至室溫的時(shí)間小于10 s。

1.2.4 活菌計(jì)數(shù) 采用稀釋涂布XLD 培養(yǎng)基進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，37 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均為3 個(gè)平行樣品測(cè)定3 次。D 值是指在某溫度下，活菌數(shù)死亡90%所需要的時(shí)間，即細(xì)菌殘存曲線經(jīng)一個(gè)對(duì)數(shù)周期所需的時(shí)間。D 值是細(xì)菌死亡率的倒數(shù)，D 值越大死亡速度越慢，該菌的耐熱性越強(qiáng)。用Linear 模型擬合熱致死曲線式中，x 表示加熱時(shí)間，y 表示細(xì)菌活細(xì)胞的對(duì)數(shù)值，可得出該函數(shù)的斜率的負(fù)倒數(shù)為所求的D 值，即D=-1/k。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺陷株P(guān)CR 鑒定

繁殖10 代后，提取缺陷株和野生株的DNA，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，可看出野生株可以擴(kuò)增出大小約795 bp 基因片段，而突變株擴(kuò)增出1 261 bp的基因片段（red 重組敲除工作中未進(jìn)行抗性基因無(wú)痕敲除，因此缺陷株的片段比野生株長(zhǎng)），不過(guò)從結(jié)果看出缺陷株無(wú)法正常表達(dá)rpoE （圖1），證實(shí)了缺陷株△rpoE 的基因穩(wěn)定性。

通過(guò)對(duì)最適溫度37 ℃下缺陷株和野生株24 h 的生長(zhǎng)情況的測(cè)定，繪制生長(zhǎng)曲線，通過(guò)菌液濃度差異來(lái)比較兩株菌生長(zhǎng)情況（圖2）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可得，37 ℃時(shí)，Mann-Whitney U test 非參數(shù)檢驗(yàn)得P＞0.05，野生株和缺陷株的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)沒(méi)有顯著性差異，可以得出兩者生長(zhǎng)的情況幾乎沒(méi)有差別，說(shuō)明在非應(yīng)激條件下，rpoE 基因的活性可能被抑制而不發(fā)揮作用。

圖1 繁殖10 代后野生株和缺陷株凝膠電泳鑒定Fig.1 Verification of the wild and mutant strain after 10 generations of reproduction

圖2 野生株和缺陷株37 ℃生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of wild strains and mutant strains at 37 ℃

2.2 甲型副傷寒沙門(mén)氏菌野生株和缺陷株在不同溫度下的熱失活效果

通過(guò)模擬肉制品加工過(guò)程中近似巴氏殺菌的條件，本試驗(yàn)選擇了55，63，72 ℃3 個(gè)溫度進(jìn)行對(duì)純瘦肉灌腸進(jìn)行熱處理。研究結(jié)果如圖3所示，甲型副傷寒沙門(mén)氏菌缺陷株和野生株的熱失活情況有所不同，缺陷株的耐熱能力弱于野生株，并且隨著樣品進(jìn)行熱處理的時(shí)間越長(zhǎng)，缺陷株的耐熱能力越弱于野生株，直至全部死亡。

圖3 野生株和缺陷株的熱失活曲線Fig.3 The survival curves of wild strains and mutant strains

2.3 甲型副傷寒沙門(mén)氏菌野生株和缺陷株在不同溫度下的耐熱性分析

殘存菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。如表1所示，利用Linear 方程求得的甲型副傷寒沙門(mén)氏菌野生株和缺陷株的熱失活模型的判定系數(shù)R2都大于0.9，并且野生株和缺陷株在55℃的D 值分別為14.0980，10.8933 min，在63 ℃的D 值分別為1.3078，0.3147 min，在72 ℃的D 值分別為0.9885，0.9135 min。3 個(gè)溫度下甲型副傷寒沙門(mén)氏菌缺陷株和野生株的D 值之間有顯著性差異（t<0.05）。隨著溫度的升高，缺陷株和野生株的D 值都隨之降低，并且3 個(gè)溫度下，甲型副傷寒沙門(mén)氏菌缺陷株的D 值都明顯低于野生株，缺陷株相對(duì)于野生株對(duì)高溫更加敏感，證明rpoE 對(duì)甲型副傷寒沙門(mén)氏菌在高溫下耐熱性發(fā)揮特定作用，rpoE 缺失會(huì)導(dǎo)致甲型副傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)高溫的抵抗能力明顯下降。

表1 甲型副傷寒沙門(mén)氏菌缺陷株和野生株熱處理D 值Table 1 D-values of Salmonella paratyphi A mutant strains and wild strains

3 討論

本研究采用的敲除方法是Baudin 等[7]提出的一種后人稱為短側(cè)翼同源區(qū)PCR 介導(dǎo)基因敲除的方法，是一種近年興起的體內(nèi)同源重組的新型遺傳工程技術(shù)[8-11]。該技術(shù)僅需要35～60 bp 的同源序列就可以完成對(duì)目的基因的精確敲除，并且重組效率極高[12]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此方法也適用于甲型副傷寒沙門(mén)氏菌基因的敲除，并且其穩(wěn)定性極好。

有研究表明，rpoE 對(duì)大腸桿菌的生存是必不可少的[13]，如大腸桿菌rpoE 的缺失會(huì)導(dǎo)致菌株立即死亡[14]。然而對(duì)于其他細(xì)菌，如鼠傷寒沙門(mén)氏菌等和具有和大腸桿菌同源性較高的細(xì)菌的生存的影響并不顯著。本研究結(jié)果顯示，從△rpoE 的傳代穩(wěn)定性和最適溫度下的生長(zhǎng)情況，可以看出rpoE的缺失并不影響甲型副傷寒沙門(mén)氏菌的生存能力，并且在最適溫度下，rpoE 基因的活性可能在沒(méi)有受到外界環(huán)境的脅迫下并不會(huì)發(fā)揮作用。

比較不同溫度下缺陷株和野生株致死情況，證明rpoE 基因?qū)仔透眰抽T(mén)氏菌的耐熱能力具有重要作用。進(jìn)一步闡明了rpoE 基因作為σ因子在甲型副傷寒沙門(mén)氏菌響應(yīng)環(huán)境脅迫過(guò)程中的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步探討甲型副傷寒沙門(mén)氏菌耐熱機(jī)理及其相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制提供了新的依據(jù)和有意義的嘗試。