蘇嘉妮 周 露

（廣東省食品檢驗所 廣東廣州 510435）

1 前言

食品安全關(guān)乎民生大事，我國每年都會發(fā)生食物中毒事件，大部分是微生物污染引起的。食品微生物檢驗作為食品安全監(jiān)測的重要手段，可以有效減少食源性疾病的發(fā)生[1]。CNAS-CL01-A001 2018《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》規(guī)定，實驗室必須保存滿足試驗需要的菌種用于檢驗方法需要的陰陽性對照、培養(yǎng)基質(zhì)量驗收、方法確認、人員培訓考核和結(jié)果質(zhì)量保證[2]，因此，菌種的保存管理，對保證微生物實驗過程的質(zhì)量控制的有效性起到至關(guān)重要的作用。菌種保存是微生物檢驗工作中的常規(guī)技術(shù)，科學保存和管理關(guān)系到檢驗結(jié)果的準確性。

2 菌種的來源

2.1 標準菌種

至少定義到屬或種水平的菌種，按菌種特性進行分類和描述，官方菌種保藏機構(gòu)獲得，最好來源于食品或水[3]。相關(guān)機構(gòu)包括美國菌種保藏中心（ATCC）、中國普通微生物菌種保藏中心（CGMCC）、工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）、中國醫(yī)學微生物菌種保藏中心（CMCC）等。

2.2 野生菌種

由日常檢驗樣品或能力驗證、盲樣考核獲得的可疑菌種，通過分離純化，生理生化試驗鑒定得到的野生菌種，或者通過其他途徑（與他人交換、贈送）獲得的非標準菌種，提供者需要提供菌種的鑒定材料，由實驗室菌種管理人員登記入庫。

3 菌種的管理

菌種的管理是實驗室一項重要的工作，實驗室用于實驗質(zhì)量控制和操作評估，保障實驗結(jié)果的準確可靠。規(guī)范化的管理菌種，要求菌種的購買、驗收、復蘇、確認、傳代、保存、使用、銷毀有文件化的程序管理，進一步加強生物安全的管理，保護實驗室人員和公眾健康[4，5]。本實驗室從人、機、料、法、環(huán)這幾方面進行菌種的全面質(zhì)量控制并形成記錄，確保其溯源性和穩(wěn)定性。

3.1 人員

菌種需要專人管理，管理人員負責菌種的申購、驗收、復蘇、驗證、傳代、保管。管理人員必須要有認真負責的態(tài)度，熟悉微生物檢驗操作，充分了解菌種的基礎(chǔ)知識，經(jīng)常積累工作經(jīng)驗，清楚知道各種菌種復蘇傳代保存所需最合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。購買菌種要選擇有資質(zhì)的機構(gòu)，菌種管理人員驗收菌種時，要檢查每一支菌種是否有質(zhì)量證明或檢驗報告單，不僅要進行外觀檢查，還需進行純度和特性的確認，確保菌種的活性。菌種管理人員從菌種接收當日，所有的活動都要形成記錄并且詳細登記，對每一支保存的菌種都有唯一性標識，包括菌種名稱、菌種號、代數(shù)、日期，保證所有購入的菌種都有完整的身份可以追溯。

3.2 儀器設(shè)備

菌種的保存需要實驗室配備相應(yīng)的設(shè)備，包括低溫冰箱、超低溫冰箱、液氮罐、冷凍干燥機等，并實行“雙人雙鎖”管理，對所有設(shè)備應(yīng)進行監(jiān)控并定期檢查和保養(yǎng)，需要溫度監(jiān)控的設(shè)備應(yīng)形成記錄，發(fā)現(xiàn)不正常及時維修。

3.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是供微生物生長的養(yǎng)料，不同菌種應(yīng)根據(jù)其生物學特性選擇合適的培養(yǎng)基，以利于菌種的生長，以下介紹食品微生物實驗室常用菌種的復蘇、傳代所用合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，詳見表1。

表1 菌種培養(yǎng)方法

3.4 菌種保存的方法

微生物具有容易發(fā)生變異的特性，因此，在保存菌種的過程中，應(yīng)挑選優(yōu)良純培養(yǎng)物并使其處于休眠狀態(tài)的基礎(chǔ)上，人為地創(chuàng)造一個有利于休眠的環(huán)境，或相對靜止使微生物的代謝處于最不活躍的狀態(tài),才能在一定的時間內(nèi)使其保持菌種原有的優(yōu)良特性，低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境可抑制微生物的生長和繁殖[6]。菌種保存時，最好采用2種以上方法或盡可能存放在2 個以上的保藏設(shè)備，可避免因保存不當導致菌種死亡或菌種意外流失的情況發(fā)生。對于基層食品微生物實驗室常使用以下方法對菌種進行保存[7]。

3.4.1 傳代保存法

此法適用于保存工作菌種。根據(jù)菌種的特性選擇適合于生長的培養(yǎng)基，純化菌種轉(zhuǎn)接于適宜的平板或瓊脂斜面培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基，經(jīng)適當?shù)臏囟群蜁r間培養(yǎng)后，用封口膜將管塞部分包扎好置于4℃左右冰箱保存，特別注意銅綠假單胞菌、副溶血性弧菌、非O1/O139 群霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌等需置于室溫保存。傳代保存時間因微生物種類不同而異，一般為一周至2～3 個月不等，該方法只適用于短期需要用的菌種保存。此法雖簡單方便，但菌種多次傳代易使菌種發(fā)生變異，微生物特性改變，因此，GB/T 27405—2008 《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品微生物檢測》規(guī)定，工作菌種傳代次數(shù)不超過5 代[8]。

3.4.2 液體石蠟保存法

液體石蠟要在121℃，30 min 高壓滅菌，滅菌后放在烘箱中，160℃左右干燥1～2 h 或40℃恒溫箱中干燥3 h，蒸發(fā)水分直至澄清透明。在傳代培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)后注入無菌液體石蠟，石蠟高度超過1 cm，使其覆蓋整個斜面或半固體，達到菌體與空氣隔絕，防止水分蒸發(fā)，減緩菌種代謝活動。將試管直立放在4℃左右冰箱保存，保存時間1年左右。保存期間要定期檢查，發(fā)現(xiàn)液體石蠟露出菌體斜面時，應(yīng)及時補充滅菌液體石蠟。

3.4.3 甘油保存法

此法適用于保存標準儲備菌種。甘油是一種低溫保護劑，低溫有利于降低微生物的活性，甘油能滲透到細胞內(nèi)，避免水結(jié)冰產(chǎn)生冰晶損傷細胞。將待保菌種通過肉湯增菌培養(yǎng)后，可用甘油原液保存，也可以用甘油—生理鹽水保存液保存，甘油含量為20%～30%[9]，保存溫度為-80～-60℃或-20℃左右，保存時間1～3年不等。

3.4.4 瓷珠保存法

此法較甘油保存法，時間更長久。將菌種接種至適宜的平板培養(yǎng)基，經(jīng)適當溫度時間培養(yǎng)后，直接刮取平皿上生長活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物置于瓷珠保藏管，濃度達到3～4 麥氏濁度，來回顛倒搖勻使細菌或孢子有效地吸附在瓷珠表面（切勿渦旋震蕩），盡可能將與菌種混勻后的保護液吸凈，避免液體反復凍融形成冰晶對菌種造成損傷，加速復蘇的過程。保存溫度為-80～-60℃，保存時間3～10年不等。

3.5 菌種保存環(huán)境及生物安全

如何保證菌種長期有效的保存，環(huán)境的控制至關(guān)重要。低溫環(huán)境可降低微生物的生長速度，因此，實驗用工作菌種常存放在2～8℃，儲備菌種存放在-20℃和-80℃。微生物菌種的保藏工作不能對周圍環(huán)境造成污染和危害，實驗過程中要無菌操作，做好個人防護，避免污染。對變異、污染、過期、使用后的菌種要及時銷毀，滅菌條件為121℃，30 min，并做好相關(guān)記錄。

菌種的管理應(yīng)嚴格按照 《病原微生物生物安全通用要求》《人間傳染的病原微生物名錄》《動物病原微生物分類名錄》及SN/T 2632—2010《微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程》的要求執(zhí)行[10]。原則上，菌種不得外借，如果要帶離實驗室需上級批準，詳細記錄，確保安全。

3.6 菌種相關(guān)記錄

記錄是保證菌種溯源性的重要文件，因此，菌種的所有記錄必須詳細登記并存檔，以下介紹標準菌種的驗收、復蘇、確認、傳代、使用、銷毀一切活動所需形成的記錄供參考[11]。

3.6.1 菌種的驗收

實驗室在接收菌種時，應(yīng)檢查其外觀的完整性，并索取標準菌種質(zhì)量證明材料或檢驗報告單，相關(guān)證明需加蓋資質(zhì)機構(gòu)的公章，并填寫接收記錄，內(nèi)容包括：菌種基礎(chǔ)信息（菌種名稱、編號、代數(shù)、數(shù)量、基質(zhì)類型）和菌種來源信息（菌種來源、購入時間、有效期）。

3.6.2 菌種的復蘇

復蘇是使用保藏菌種的第一步，活化菌種使其恢復旺盛的生命活力，按照菌種說明書的要求進行復蘇。

3.6.3 菌種的確認

菌種活化后，需要進行菌種純度和特性的確認，并填寫確認記錄，內(nèi)容包括菌種名稱、編號、驗證依據(jù)、革蘭氏染色、分離培養(yǎng)形態(tài)鑒定、生化試驗、鑒定人員、結(jié)果判定。對鑒定結(jié)果符合的菌種才可以進行保存和傳代。

3.6.4 菌種的傳代

從具有資質(zhì)認定資格的機構(gòu)購買的質(zhì)控菌種為0 代，菌種通過介質(zhì)培養(yǎng)增加1 代，傳代不超過5 代，填寫傳代記錄表，內(nèi)容包括：菌種名稱、母代編號、代數(shù)、制成代編號、保種基質(zhì)、數(shù)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和時間、存放溫度、保存時間、操作者。

3.6.5 菌種使用和銷毀

菌種使用需經(jīng)管理人同意，并填寫領(lǐng)用記錄，內(nèi)容包括：菌種名稱及編號、使用日期、用途、使用人和管理人簽字確認。菌種銷毀應(yīng)嚴格遵守生物安全制度，填寫銷毀記錄及滅菌記錄。

4 結(jié)語

菌種作為重要的標準物質(zhì)，實驗室應(yīng)制定符合實驗室自身情況的菌種管理工作細則，并嚴格執(zhí)行。菌種應(yīng)從認可機構(gòu)購買并附有證書。菌種保存需從人、機、料、法及環(huán)5 方面進行控制，并保證實驗過程操作規(guī)范，避免菌種污染，同時注意生物安全，做好個人防護。實驗室菌種的管理需要制定文件化的程序，從申購、保管、領(lǐng)用、使用、傳代等方面規(guī)范化，確保溯源性和穩(wěn)定性，才能保證菌種資源長期有效的保藏，以便用于日常使用及交流、研究。