余華軍， 吳 尚， 黃 慧， 林碧云， 伍 俊， 歐華俊， 張海濤

(廣東醫(yī)科大學1. 實驗動物中心， 湛江 524023；2. 生物化學與分子生物學教研室， 湛江 524023；3. 附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湛江 524001)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)的病因不明，可由環(huán)境中的有害物質(zhì)、病毒感染、胃食管反流和吸煙等因素刺激，通過炎癥、組織損傷、修復持續(xù)疊加造成上皮細胞損傷和成纖維細胞活化，引起細胞外基質(zhì)沉積，最終發(fā)展為肺纖維化。建立穩(wěn)定的肺纖維化動物模型，對抗肺纖維化藥物篩選和評價極其重要。目前國際上應用最為廣泛的是博來霉素誘導動物肺纖維化模型。該模型主要通過氣管給藥、經(jīng)鼻滴注、腹腔注射或靜脈給藥等方法建立[1-4]，其中一次性氣管內(nèi)灌注的方法使用較為普遍。氣管內(nèi)灌注又分為直接灌注和間接灌注，兩者主要是有創(chuàng)與無創(chuàng)的區(qū)別。在肺纖維化小鼠模型制備的動物選擇方面，C57BL/6J 小鼠是最常用品系[5]。目前研究及應用的小鼠氣管插管給藥方法中，大多借助于專用儀器設(shè)備輔助插管。但普遍存在的不足是小鼠咽部結(jié)構(gòu)視野范圍較小及模糊，不能清晰直觀進行插管操作。本研究擬采用在多功能內(nèi)窺鏡直視下對C57BL/6J小鼠進行氣管插管，并通過此方法建立博來霉素誘導小鼠肺纖維化模型，分析及評價動物模型的穩(wěn)定性，為今后氣管給藥、肺纖維化及相關(guān)肺部疾病的研究應用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6J 小鼠15 只，18～22 g，雌雄各半，購自中山大學實驗動物中心[SCXK(粵)2016-0029]。常規(guī)飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學實驗動物中心SPF 級設(shè)施，12/12 h 晝夜光照，溫度 22～24 ℃，相對濕度 70%[SYXK(粵)2015-0147]。

1.2 主要試劑和儀器

博來霉素購自美國Sigma 公司； 羥脯胺酸(HYP)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)測試盒均購自南京建成公司；生理鹽水、水合氯醛、內(nèi)窺鏡、冷光源放大鏡和恒溫加熱板均購自北京鼎國公司； 病理組織切片機和石蠟包埋機均購自美國賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)窺鏡直視下氣管插管操作步驟 ①使用體積分數(shù)10%水合氯醛麻醉5 只小鼠，對照組和實驗組各5 只； ②用絲線圈住小鼠門牙將小鼠懸掛在木板上，背部用泡沫墊高，保持頭部和水平的角度在45°左右，用鑷子輕輕順向拉出舌頭； ③冷光源放大鏡放于動物上部，用咽拭子將咽部分泌物擦凈，使用棉簽下壓舌部調(diào)整動物傾斜角度； ④使用已酒精消毒的內(nèi)窺鏡探頭伸入小鼠口腔內(nèi)，調(diào)整角度直至可通過內(nèi)窺鏡顯示面板清晰看到聲門，固定探頭軟管； ⑤手持氣管導管貼門牙中間進針，沿著上顎中線插入，觀察小鼠呼吸頻率，在小鼠呼吸時，聲門打開的瞬間插入導管，注入50 μL 印度墨汁； ⑥迅速從氣道拔出套管針，抓著小鼠耳背皮膚直立旋轉(zhuǎn)30 s，使藥物在肺內(nèi)分布均勻，側(cè)臥位放置于恒溫加熱板(37 ℃)上。

1.3.2 實驗處理 對照組和實驗組各5 只，按上述操作步驟，分別氣管給予50 μL的生理鹽水和50 μL平3.5 mg/kg 的博來霉素[6]。

1.3.3 博來霉素誘導小鼠肺纖維化模型鑒定 常規(guī)飼養(yǎng)28 d[7]，頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠左肺浸于質(zhì)量分數(shù)4%的多聚甲醛溶液中固定，進行石蠟包埋，病理切片，HE、Masson 染色，小鼠右肺進行HYP、MDA、GSH-PX、SOD 檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料用x- ± s表示， 多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析， 兩組間比較采用t 檢驗， P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 多功能內(nèi)窺鏡直視下氣管插管

在多功能內(nèi)窺鏡顯示面板上掌握小鼠的呼吸頻率，在聲門打開瞬間迅速插入導管，一邊管口封堵30 s，小鼠此時出現(xiàn)躁動、口唇紫紺等缺氧癥狀，解除封堵后小鼠呼吸恢復、缺氧癥狀逐漸緩解，則表明插管成功[8]。

2.2 插管過程

按照上述的氣管插管方法，使用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖暴露氣管及胸腔，發(fā)現(xiàn)5 只注入印度墨汁的小鼠氣管下端直至肺部均有黑色物質(zhì)均勻分布(圖1)。且各組小鼠均插管成功，插管成功率高，給藥量精確，插管后無小鼠死亡情況。

2.3 博來霉素誘導小鼠肺纖維化模型

由表1可見，小鼠肺組織中HYP、MDA含量，與對照組比較，實驗組含量增加(P＜0.01)； 小鼠肺組織中GSH-PX、SOD 活性，與對照組比較，實驗組活性降低(P＜0.01)。小鼠肺組織進行病理切片經(jīng)HE、Masson 染色， 顯微鏡下觀察(圖2)， 對照組的肺組織結(jié)構(gòu)清晰， 實驗組肺泡間隔顯著變寬， 肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴重，萎縮塌陷嚴重，膠原纖維顯著增多，出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤。從以上生化指標及病理學觀察結(jié)果表明，應用該氣管插管方法，復制博來霉素誘導小鼠肺纖維化的模型成功率較高。

3 討論

在醫(yī)學研究上， 人們通常借助于人類疾病動物模型來認識和研究各種疾病的發(fā)展及防治。建立合適的肺纖維化動物模型對臨床上治療肺纖維化疾病藥物的篩選， 探討其發(fā)病機制具有重要的作用。誘導肺纖維化常用博來霉素、二氧化硅、異硫氰酸熒光素， 通過輻射、病毒載體和轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)等[9，10]。應用博來霉素來誘導肺纖維化是目前最普遍的實驗性肺纖維化動物模型[11-14]。博來霉素的造模給藥途徑有氣管內(nèi)滴入、霧化吸入、腹腔注射和靜脈注射等方式，但各有優(yōu)缺點。

圖1 多功能內(nèi)窺鏡直視下氣管插管Figure 1 Endotracheal intubation under direct vision

表1 小鼠肺組織中的生化指標Table 1 The lung indexes of mice

圖2 小鼠肺纖維化的病理變化Figure 2 Pathological changes of pulmonary fibrosis in mice

Robbe等[15]使用霧化裝置霧化方式吸入博來霉素，誘導大鼠肺間質(zhì)纖維化。此方法避免了大鼠手術(shù)感染的風險，提高了造模成功率及肺內(nèi)博來霉素分布均勻，但此方法消耗的博來霉素量大，不能定量且霧化時間過長。有研究[16]報道采用一次性大劑量和連續(xù)多次小劑量尾靜脈注射博來霉素造模，此方法復制的動物模型更接近于特發(fā)性肺纖維化，但進行尾靜脈注射對實驗人員的技術(shù)操作要求較高。此外，腹腔內(nèi)多次注射博來霉素建立的肺纖維化模型[17]，亦存在給藥次數(shù)多、劑量大和造模時間長等缺點。

目前國內(nèi)外最常用、最受認可的是一次性氣管內(nèi)灌注博來霉素誘導的動物肺纖維化模型[18]。直接灌注法是通過氣管插管向氣管內(nèi)灌注博來霉素，間接灌注法是在動物頸部切口，找到氣管后向氣管內(nèi)注入博來霉素。在氣管給藥時，研究者更多采用氣管切開后滴注的方法，但這種方法對小鼠造成有創(chuàng)損傷，影響實驗的重復性及各項生理指標。比較以上給藥方式，最理想的是采用無創(chuàng)的方式，一次性氣管內(nèi)灌注博來霉素誘導肺纖維化，但這種方法操作技術(shù)要求高，需借助一些儀器設(shè)備。實驗人員通常利用專門儀器設(shè)備進行輔助插管。如Brown 等[19]和Spoelstra 等[20]在專業(yè)喉鏡引導下進行氣管插管給藥。Vergari 等[21]利用關(guān)節(jié)鏡對小鼠進行氣管插管，雖然成功率高，損傷小，但是需要特殊設(shè)備，成本高。本實驗采用內(nèi)窺鏡輔助下實施小鼠氣管插管，利用內(nèi)窺鏡探頭冷光源進行調(diào)節(jié)光亮度及放大倍數(shù)，實驗人員能在內(nèi)窺鏡的面板上更好地觀察咽喉部的結(jié)構(gòu)、小鼠的呼吸頻率及聲門的開啟時間， 掌握插管的方向， 提高插管的成功率。

HYP含量能直接反映出結(jié)締組織疾病的膠原代謝情況，通過檢測組織中HYP含量， 可以判斷組織纖維化程度，還可以對預防與治療纖維化藥物的篩選。而MDA 常與SOD 的檢測相互配合， SOD 的活性高低間接反映機體清除氧自由基的能力， 而MDA的高低則反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。GSH-PX能特異催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應，起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和維持正常功能的作用。通過此方法建立的小鼠肺纖維化模型，實驗結(jié)果顯示小鼠肺組織中HYP、MDA含量， 與對照組比較， 實驗組含量均增加； 小鼠肺組織中GSH-PX、SOD 活性，與對照組比較，實驗組含量均降低。小鼠肺組織進行病理切片，經(jīng)HE、Masson 染色，顯微鏡下觀察實驗組膠原纖維沉積嚴重。從以上生化指標及切片結(jié)果顯示，應用該氣管插管方法，復制博來霉素誘導小鼠肺纖維化的模型成功率較高，且對小鼠造成的損傷較小。

綜上，在多功能內(nèi)窺鏡直視下的小鼠氣管插管方法是一種操作便捷、成功率高、重復性好、安全性高的插管方法； 可正常通過小鼠口腔觀察氣管，有效地實現(xiàn)小鼠肺部給藥， 實驗人員只需經(jīng)過數(shù)次練習即可熟練開展實驗，具有一定的優(yōu)越性和實用價值，值得推廣應用。