孫 俠， 劉香梅， 龐增雄， 劉冬虹， 徐穎愉， 江 漪， 李 敏， 丘智峰， 黃宇鋒

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院， 廣州511447)

太陽光中的紫外線會對生物產(chǎn)生損傷， 依據(jù)不同的生物學損傷效應，可根據(jù)波長分為短波紫外線(UVC， 100～280 nm)、中波紫外線(UVB， 280～320 nm)和長波紫外線(UVA， 320～400 nm)[1]。其中波長最短的UVC 可對生物產(chǎn)生較強的破壞作用，但由于臭氧層的存在，UVC 幾乎到達不了地球表面； UVB具有中等穿透力，主要穿透皮膚的角質(zhì)層和表皮層，僅有不足2% 能到達地球表面，它對皮膚較淺的人體皮膚產(chǎn)生的效應主要是急性的紅斑反應以及隨后一定程度的色素沉積； 地球表面超過98%的紫外線是UVA，UVA 具有很強的穿透力，能穿透人體的角質(zhì)層、表皮層、真皮層從而殃及皮下組織，可造成嚴重和持久的皮膚危害[2]。

根據(jù)《衛(wèi)生部化妝品檢驗規(guī)定》(2002 年版)要求[3]， 具有紫外線吸收功能的化妝品必須進行光毒性試驗安全性檢驗。在衛(wèi)生部“化妝品衛(wèi)生規(guī)范”(2007年版)中皮膚光毒性試驗方法規(guī)定了30 min的皮膚光毒性試驗[4]。但日常生活中， 太陽光的照射時間常常大于30 min， 為探討不同輻射時間紫外線引起的皮膚光毒性損傷作用， 本實驗采用UVA(4.5mJ·cm-2·s-1)+UVB(0.036mJ·cm-2·s-1)輻射的方法，建立紫外線致皮膚光毒性損傷實驗動物模型，并對不同時間紫外照射引起的SD大鼠皮膚光毒性損傷進行了比較分析，為皮膚光毒性損傷研究提供背景數(shù)據(jù)，并為進一步防曬功效評價提供合適的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雌性SD 大鼠， 28 只， 體質(zhì)量180 ～220 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供[SCXK(粵)2013-0002]。動物飼養(yǎng)于廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院毒理實驗室[SYXK(粵)2014-0137]。動物實驗方法經(jīng)院動物福利和倫理委員會審核批準，所有操作均符合3 R 原則。

1.2 主要試劑

抗波形蛋白(Anti-Vimentin)抗體、抗黑色素瘤(Anti-Melanoma)抗體和抗CD34 抗體均購自英國Abcam 公司； 小鼠和兔二步法試劑盒購自中杉金橋公司； DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.3 主要儀器

皮膚光毒性試驗檢測儀(型號： HOPE-MED 8130B)購自天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司； ES全封閉組織脫水機(型號： Excelsior)、組織包埋機(型號：HistoStar)、石蠟切片機(型號： HM340E)、烘片機(型號： Slimline Hotplate)、自動染片機(型號： Gemini AS) 和自動封片機(型號： CTM 6)均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司； 顯微鏡(型號： ZEISS Lab. A1)購自卡爾蔡司光學(中國)有限公司； 電子天平(型號： 雙杰JJ3000)購自雙杰電子天平公司。

1.4 造模方法

28 只大鼠隨機分成空白對照組、模型1 組、模型2 組和模型3 組，每組7 只。除空白對照組外，其余各組予以紫外線照射。每次照射前，在大鼠背部3 cm×3 cm 區(qū)域內(nèi)剃毛，使皮膚充分暴露， 將大鼠放在皮膚光毒性試驗檢測儀(UVA+UVB)燈具正下方的30 cm 處照射， 輻射參數(shù)設為UVA(4.5 mJ·cm-2·s-1)+ UVB(0.036 mJ·cm-2·s-1)，每周照射2 次， 連續(xù)照射4 周， 共8 次。模型1 組8 次照射時間分別為6 min、12 min、24 min、36 min、48 min、60 min、72 min、84 min，8 次累計共342 min。模型2 組8 次照射時間分別為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，累計共440 min。模型3 組8 次照射時間分別為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、100 min，累計共520 min。

1.5 檢測指標

1.5.1 皮膚刺激反應 每次照射后觀察皮膚反應，并按表1 對皮膚刺激反應進行評分(紅斑和焦痂形成、水腫分別積分，最高積分為8 分)。

1.5.2 病理學觀察 取照射部位皮膚1 cm×1 cm大小， 用質(zhì)量分數(shù)4%中性甲醛溶液固定， 進行常規(guī)脫水、包埋、切片， HE 染色， 光學顯微鏡觀察并照相， 觀察各組之間照射部位皮膚病理學形態(tài)差異。在高倍顯微鏡下， 用ZEN2病理圖文分析軟件測量皮膚的表皮厚度和真皮層皮脂腺的橫截面積， 參照GB7919-87《化妝品安全性評價程序和方法》按表2進行皮膚損傷評分， 總分按(a+b+c+d+e+f+g+i+j+k)或(h+i+j+k)選擇總分較大者。

1.5.3 免疫組織化學檢測 用黑色素瘤特異性標記(HMB45)抗體檢測皮膚表皮層黑素細胞變化，用Vimentin 抗體檢測真皮層成纖維細胞增生情況，用CD34 抗體檢測真皮層微血管的生成情況。

1.6 統(tǒng)計分析

所測數(shù)據(jù)采用Excel錄入和SPSS21.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異采用t 檢驗、方差分析和多重比較(LSD 法)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 皮膚組織大體觀察

正常對照組大鼠皮膚未見明顯異常， 模型1 組、模型2 組、模型3 組大鼠皮膚略黃，各組均未見明顯紅斑和水腫形成。

表1 大鼠皮膚刺激反應評分Table 1 Score of skin irritation response

表2 大鼠皮膚損傷評分標準Table 2 Score standard of skin injury

2.2 皮膚組織病理學觀察

正常對照組大鼠的背部皮膚表皮由角質(zhì)層、顆粒層、棘細胞層和基底細胞層構成，顆粒層和棘細胞層的細胞數(shù)較少，表皮厚薄均勻(圖1A1)； 真皮層由乳頭層(真皮淺層)和網(wǎng)狀層(真皮深層)組成，膠原纖維是真皮結締組織中最為豐富的成分，彈力纖維數(shù)量較膠原纖維少，較均勻散在分布在膠原束之間(圖1A2)； 真皮層皮膚附件由毛囊、皮脂腺組成，均未見明顯異常(圖1A3)。模型1 組大鼠背部部分皮膚表皮角化過度(角質(zhì)層、顆粒層增厚)，棘層肥厚(表皮為正常厚度1.6～2.7 倍)，表皮厚薄不均，皺紋明顯加深，真皮層散在的成纖維細胞增生(圖1B1、圖1B2)； 真皮層毛囊增大，皮脂腺增生(圖1B3)。模型2 組大鼠背部部分皮膚表皮角化過度(角質(zhì)層、顆粒層增厚)，棘層肥厚(表皮為正常厚度1.5～2.9 倍)，表皮厚薄不均，皺紋明顯，真皮層少量膠原纖維變性伴少量成纖維細胞增生，局部散在炎細胞浸潤(圖1C1、圖1C2)； 真皮層毛囊增大，皮脂腺增生(圖1C3)。模型3 組大鼠背部部分皮膚表皮角化過度(角質(zhì)層、顆粒層增厚)，棘層肥厚(表皮為正常厚度1.5～3.7 倍)，表皮厚薄不均，皺紋明顯，部分表皮細胞空泡化，真皮層纖維排列較亂，部分膠原纖維變性伴部分成纖維細胞增生，局部少量炎細胞浸潤(圖1D1、圖1D2)； 真皮層毛囊增大，皮脂腺增生(圖1D3)。

2.3 各組大鼠皮膚表皮厚度和真皮層皮脂腺橫截面 積比較

表皮厚度和真皮層皮脂腺橫截面積測定結果顯示(表3)，模型1 組、模型2 組、模型3 組均較正常對照組顯著增厚或增大(P＜0.05)，且隨著輻照時間增加，增厚或增大更為明顯。

2.4 皮膚損傷評分

模型1 組： 棘層肥厚1 分，角質(zhì)層增厚1 分，顆粒層增厚1 分； 模型2 組： 棘層肥厚1 分，角質(zhì)層增厚1 分，顆粒層增厚1 分，真皮層少量炎細胞浸潤1 分，少量膠原纖維變性伴少量成纖維細胞增生1 分； 模型3 組： 棘層肥厚1～2 分，角質(zhì)層增厚1 分，顆粒層增厚1 分，部分表皮細胞空泡化1 分，真皮層炎細胞浸潤1 分，部分膠原纖維變性伴部分成纖維細胞增生1 分。與正常對照組比較，模型1 組、模型2 組、模型3 組皮膚損傷評分均顯著升高(P＜0.05)，且照射時間越長，皮膚損傷的程度越重(表4)。

2.5 免疫組織化學觀察

根據(jù)圖2 結果，正常對照組(圖2a1)、模型1組(圖2b1)皮膚未見明顯HMB45 的表達； 模型2組(圖2c1)、模型3 組(圖2d1)局部皮膚可見少量細胞表達HMB45，表達部位位于表皮基底層和毛囊的上皮層。

正常對照組(圖2a2)皮膚真皮層見散在的成纖維細胞Vimentin表達(細胞數(shù)≤10個/高倍視野)； 模型1組(圖2b2)皮膚真皮層見成纖維細胞Vimentin表達增多(細胞數(shù)＞10 且≤20 個/高倍視野)； 模型2 組(圖2c2)、模型3 組(圖2d2)皮膚真皮層見成纖維細胞Vimentin表達明顯增多(細胞數(shù)＞20個/高倍視野)。

圖1 紫外線照射大鼠皮膚組織病理學觀察

表3 各組大鼠皮膚表皮厚度和真皮層皮脂腺橫截面積比較Table 3 Comparison of skin epidermal thickness and cross section area of sebaceous glands in dermis of SD rats in each group

表4 各組大鼠皮膚損傷評分比較 Table 4 Comparison of skin injury scores of SD rats in each group

正常對照組(圖2a3)SD大鼠背部皮膚真皮層毛細血管CD34 的表達較少； 模型1 組(圖2b3)、模型2 組(圖2c3)、模型3 組(圖2d3)大鼠背部皮膚真皮層毛細血管CD34 的表達均較正常對照組明顯增多。

3 討論

本研究在輻照參數(shù)UVA(4.5 mJ·cm-2·s-1)+UVB(0.036 mJ·cm-2·s-1)不變的基礎上，通過延長輻照時間，設置了3個不同輻照劑量的模型組，其中， 模型1 組累計輻照時間為342 min，模型2 組累計輻照時間為440 min， 模型3 組累計輻照時間為520 min。根據(jù)皮膚組織病理學分析結果， 模型1 組大鼠皮膚表皮損傷較明顯， 真皮損傷較輕； 模型2組大鼠皮膚表皮損傷較明顯， 真皮損傷較模型1 組加重； 模型3組大鼠皮膚表皮損傷和真皮損傷均較模型1 組加重?？梢姡S著紫外照射時間的延長，皮膚損傷程度也逐漸加重。楊汝斌等[5]采用UVA+UVB輻射成功建立SD 大鼠光老化模型， 造模結束時UVA、UVB 輻照強度累計分別為148.5J·cm-2和21.38J·cm-2。樓彩霞等[6]采用更接近日光UVA、UVB 比例的輻照參數(shù)，造模結束時UVA、UVB 輻照強度累計分別為123J·cm-2和5J·cm-2， 成功建立了大鼠光老化模型，皮膚損傷程度較楊汝斌等報道的有所減輕。本實驗采用的UVA 累計照射量與上述報道基本一致， 而UVB 累計照射量則明顯降低，真皮層未見明顯的出血改變，皮膚病理改變也相應減輕，更能模擬人類皮膚經(jīng)紫外線照射后的表現(xiàn)，也更適合于防曬化妝品的防曬功效評價。

圖2 紫外線照射大鼠皮膚組織免疫組織化學觀察

HMB45是Gown等[7]發(fā)現(xiàn)的能與黑素瘤的一種抗原結合的單克隆抗體， 它能識別前黑素小體球蛋白，可與增生活躍的黑素細胞及黑素瘤細胞起反應[8]。Vimentin 是間質(zhì)細胞中最主要的中間纖維，與皮膚損傷后修復及瘢痕增生有關[9]。CD34 是細胞表面的一種磷酸化糖蛋白，選擇性地表達于造血干/祖細胞、小血管內(nèi)皮細胞等表面[10]，也可作為微血管再生的一個標記蛋白[11]。本實驗結果顯示： 空白對照組和模型1 組大鼠皮膚未見明顯HMB45 的表達，模型2 組、模型3 組大鼠局部皮膚可見少量細胞表達HMB45，而3個模型組的Vimentin和CD34表達都增多。結果表明長時間紫外線照射可促進皮膚黑色素細胞增生，紫外輻照可造成皮膚損傷，紫外輻照可促進微血管的生成，這些效應可隨輻照時間延長而更加嚴重。

本實驗采用UVA+UVB紫外線輻射的方法，成功建立了皮膚光毒性損傷實驗動物模型，同時結合毒性病理學評價方法，分析比較了表皮厚度、表皮黑色素細胞H M B 4 5 表達、真皮成纖維細胞Vimentin 表達、真皮毛細血管CD34 表達、皮膚損傷評分等病理學指標。這些指標易于觀察和量化，相比人體防曬系數(shù)(SPF)和防曬時間(PA)測試結果，更能直觀反應防曬化妝品對紫外線引起的皮膚深層光損傷的防護作用，可用于防曬化妝品防曬功效評價。本實驗的模型2 組、模型3 組SD 大鼠皮膚HMB45 表達、皮膚光毒性損傷程度均明顯加重，或可作為評價防曬化妝品功效的動物模型。