史向華， 楊文彬， 薛潤苗， 趙靜宇， 續(xù) 艷， 張彩峰， 柴秋彥

(山西省醫(yī)藥與生命科學研究院藥理研究室， 太原 030006)

維生素D3(VitD3)屬脂溶性維生素，是維持生命所必須的營養(yǎng)素之一， 它有兩種形式， 即膽鈣化醇(VitD3)和角骨化醇(VitD2)[1]。VitD3對人體的骨骼發(fā)育極為重要，其主要功能是促進鈣、磷在腸道的吸收， 維持血清鈣和磷的濃度在正常范圍內(nèi)，并促進鈣在骨組織中的沉積，維持人體骨骼的健全以及神經(jīng)肌肉功能的正常。此外，VitD3還具有免疫調(diào)節(jié)功能，參與人體對感染的反應。當VitD3不足時，在小兒可引起佝僂病(俗稱缺鈣)， 在成人則可引起骨軟化癥(特別是妊娠和哺乳期的婦女)，與老年人的骨質疏松癥也有密切關系。目前，維生素VitD3在臨床得到了廣泛的使用，作為動物生長和維持生命所必須的營養(yǎng)素之一，在動物飼料配制中，也進行了大量的添加使用。VitD3雖是發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)成分，但并不是攝入越多越好，過量服用會引起中毒[2]。VitD3中毒常是因為使用不當，或是在治療佝僂病的過程中反復大量使用VitD3所致[3]。VitD3產(chǎn)生的中毒癥狀是通過增加腸鈣的吸收而造成血液中鈣水平升高所引起的。當血清鈣濃度超過110～130 mg/L 時，出現(xiàn)全身癥狀，如乏力、口渴、食欲不振、意識障礙等。急劇發(fā)生重癥高鈣血癥會引發(fā)高鈣血癥性腎危象，表現(xiàn)為以急性腎小管壞死為特征的急性腎功衰竭[4]。在某些情況下，腎損害可能是不可逆轉的。本實驗擬通過給大鼠攝入大劑量的VitD3，探討中毒劑量VitD3對腎功能的生化指標、腎組織自由基及鈣離子沉積的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級5 周齡SD 大鼠，40 只，雄雌各半，體質量150～170 g，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK(冀)2008-1003]，飼養(yǎng)于山西省醫(yī)藥與生命科學研究院藥理研究室SPF屏障級動物房[SYXK(晉)2017-0001]。

1.2 主要試劑

VitD3注射液(7.5 mg/mL)， 購自上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(批號： 20100106)； 超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(批號： 20130408)， 丙二醛(MDA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)和尿酸(UA)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所(批號： 20130416)，血液鈣(Ca2+)定量檢測試劑盒，購自中生北控物科技股份有限公司(批號： 2010416)。

1.3 主要儀器

電子天平(型號BT2202S)購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司， 全自動生化分析儀(型號ChemWell 2910)購自金西盟(北京)儀器有限公司， 半自動酶標儀(型號R960型)購自長春賽諾邁德醫(yī)學技術有限公司， 光學顯微鏡(型號BH-2 型)購自日本Olympus 公司， 全自動五分類動物專用血液分析儀( 型號HEMAVET950型)購自北京卓越勵新有限責任公司，原子吸收光譜儀(型號DUOAA)購自安捷倫科技(中國)有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 將40 只SD 大鼠隨機分為正常對照組、VitD3低劑量組(1 875 IU/kg 組，VitD3Ⅰ)、VitD3中劑量組(3 750 IU/kg 組，VitD3Ⅱ)、VitD3高劑量組(7 500 IU/kg 組，VitD3Ⅲ)和VitD3超高劑量組(15 000 IU/kg 組，VitD3Ⅳ)5 組，每組8 只，雌雄各半； 動物在實驗前不禁食，不禁水。

1.4.2 給藥途徑、劑量和時間 VitD3注射液，以玉米油進行等量遞增稀釋，分別配成所需濃度，每日臨用時現(xiàn)配。每日灌胃給藥1 次，給藥體積為 0.5 mL/100 g，連續(xù)3 周； 對照組大鼠灌胃等量生理鹽水。

1.4.3 樣本采集 血清樣本采集，禁食過夜后稱量體質量，用乙醚麻醉大鼠，采用腹主動脈采血，血樣自然凝固后離心(4 ℃，3 000 r/min) 10 min，取上清液貯存于-4 ℃待測。

腎組織Ca2+含量測定樣品制備，精確稱取干燥后樣本約0.5 g 于250 mL 高型燒杯，加混合酸消化液20～30 mL，上蓋表面皿。置于電熱板或沙浴上加熱消化。如未消化好而酸液過少時，補加消化液， 繼續(xù)消化， 直至無色透明。加5 mL 水， 加熱以除去多余的硝酸。待燒杯中液體量約2～3 mL時，取下冷卻。用20 g/L 氧化鑭溶液洗并轉移于10 mL 刻度試管中，定容待測。

1.4.4 樣本測定 體質量增長測定， 分別在實驗1 d、9 d、18 d、21 d 用電子天平稱量并記錄體質量。

血清生化指標測定，利用全自動生化分析儀測定各組大鼠血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)； 按試劑盒說明書分別測定MDA、SOD。

腎組織Ca2+含量測定， 取腎組織精密稱量， 按1∶9 加入冷藏的生理鹽水， 剪碎， 勻漿， 3 000 r/min離心10 min，取上清液，以原子吸收光譜儀測定；取與消化試樣相同量的混合酸消化液，按上述操作試劑空白測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

SPSS l9.0統(tǒng)計軟件進行分析， 實驗數(shù)據(jù)以x- ± s表示，組間比較采用LSD-t 法進行分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況

對照組大鼠精神狀態(tài)良好，被毛光亮，活動如常，能自由進食飲水。Vit D3用藥各組大鼠，在1 周時，外觀被毛、活動、飲食、排便及體質量增長等一般狀況，與對照組無明顯差別； 2 周時，VitD3Ⅲ和VitD3Ⅳ組大鼠的一般狀況欠佳； 3 周時，VitD3Ⅲ和VitD3Ⅳ組大鼠活動及飲食明顯減少，被毛無色澤。

2.2 大鼠體質量

3 周后，VitD3 Ⅲ和Ⅳ組雄性大鼠的體質量增長明顯降低(P＜0.05)； 雌性大鼠體質量增長略有減緩(P＞0.05)。與低劑量組比較，VitD3Ⅲ和Ⅳ在連續(xù)給藥21 d，雄性大鼠體質量隨著劑量的增加，體質量增長明顯減緩(P＜0.05)， 給藥期間，雌性大鼠體質量無明顯變化，詳見表1。

2.3 大鼠血清BUN 和Cre 濃度

連續(xù)3 周后，與對照組比較， VitD3Ⅲ和Ⅳ組大鼠BUN 含量明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)； 各劑量組大鼠Cre 含量隨著劑量增加明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)，詳見表2。

2.4 大鼠血清和腎組織 Ca2+、SOD 和MDA 含量

給藥3周后，VitD3中劑量起各組大鼠血清Ca2+含量明顯上升(P＜0.05， P＜0.01)(表3)； 腎組織Ca2+含量隨著劑量的增加逐漸升高(P＜0.05， P＜0.01)(表3)。

用藥3 周后，與對照組比較， VitD3Ⅲ和Ⅳ組大鼠血清SOD含量隨著劑量的增加逐漸降低(P＜0.05，P＜0.01)； VitD3Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組大鼠血清MDA含量隨著劑量增加逐漸升高(P＜0.05， P＜0.01)(表3)。用藥3 周后，與對照組比較，VitD3Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ劑量組大鼠腎組織勻漿MDA含量未見明顯的變化， VitD3Ⅳ組MDA 含量均明顯降低(P＜0.01)(表3)。

表1 VitD3 對大鼠體質量的影響 g

表2 VitD3 對各組大鼠BUN 和Cre 的影響

3 討論

體質量增長是反映實驗動物一般生理狀況的重要指標，特別是在藥物的毒性實驗評價中，是必須考察的項目。本實驗結果顯示， Vit D3用藥組大鼠在連續(xù)3周用藥后， 體質量增長均有減緩， 與對照組相比， 雌性大鼠差異無統(tǒng)計學意義， 但雄性大鼠體質量增長則明顯降低， Vit D3在7 500 IU、15 000 IU劑量時， 增長停滯， 體質量下降， 說明在此劑量時， 對大鼠的正常生理代謝功能造成了嚴重干擾， 出現(xiàn)了明顯的毒性。并說明雄性大鼠比雌性大鼠更為敏感。

表3 VitD3 對各組大鼠血清和腎組織 Ca2+、SOD 和MDA 含量

血清BUN、Cre含量是臨床上反映機體腎臟功能的常用指標， 其含量的高低， 可以敏感反映腎小球的濾過功能和損害程度[5]。在有關實驗性腎功能損傷的研究中，都把血清BUN、Cre 含量作為衡量腎功能的主要指標之一，但尚未見大劑量Vit D3使用于大鼠造成中毒而引起血清BUN、Cre含量升高的報道。本實驗結果顯示，在中毒劑量范圍內(nèi)的大鼠血清BUN、Cre含量隨著劑量的增加而相應的下降， 同對照組比較， 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，可能在此中毒劑量時， 嚴重干擾了大鼠體內(nèi)蛋白質和肌肉的合成和代謝， 使相應的代謝產(chǎn)物減少所致。

近年來的研究[6]表明，氧化應激損傷是腎損傷發(fā)病的重要機制之一。有文獻[7]通過實驗證實VitD3能促進氧化作用產(chǎn)生過氧化物即VitD3自由基，后者造成細胞膜的脂質過氧化，引起組織損傷。細胞膜受損后，即使血鈣不升高，也可發(fā)生營養(yǎng)不良性鈣化。本實驗所用劑量下，大鼠血液過氧化物歧化酶SOD 含量明顯降低，MDA 含量明顯上升，說明實驗大鼠使用VitD3可以使血清中SOD濃度下降，MDA 活性增高，造成腎臟組織的自由基損傷，同文獻報道的研究結果相似。同時也提示大劑量使用VitD3后造成機體自由基增加造成的氧化應激性損傷，可能是大劑量使用VitD3后產(chǎn)生腎臟毒性作用的機制之一。

實驗結果表明，1 875～7 500 IU/kg 劑量下，大鼠腎組織勻漿SOD、MDA 含量沒有明顯變化，但在15 000/kg 劑量時明顯降低， 與大鼠血清SOD、MDA 含量測定結果相反，排除實驗結果誤差外，尚無法作出合理的解釋，有待進一步研究探討。VitD3用藥組腎組織Ca2+含量隨著劑量的增加逐漸升高，與對照組比較，差異有顯著或十分顯著的統(tǒng)計學意義，說明大劑量使用VitD3時可造成大量Ca2+在腎組織中沉積，是造成腎臟毒性的主要原因。結果同以往文獻[8，9]報道結果一致。

本實驗結果表明， VitD3在7500～15 000 IU/kg 劑量，已經(jīng)達到引起大鼠腎臟毒性的劑量。