高一龍， 賀星亮， 強(qiáng)京寧， 宋珍華， 溫 海， 陶曉冉， 孫 勇， 秦海斌， 包喜軍， 孟 戈， 朱 騫

(公安部南京警犬研究所， 警犬技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南京 210012)

鑒于犬的嗅覺(jué)能力突出， 目前各國(guó)警方廣泛應(yīng)用訓(xùn)練有素的工作犬搜查諸如爆炸物、毒品等隱匿的違禁品，打擊和預(yù)防犯罪。警犬的嗅探能力是受犬嗅覺(jué)受體(OR)基因調(diào)控的，因此如果能夠運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)開(kāi)展警犬嗅探能力與OR 基因之間的關(guān)聯(lián)性研究工作，發(fā)現(xiàn)主要的分子標(biāo)記來(lái)挑選嗅覺(jué)靈敏的受訓(xùn)犬，可以顯著提高警犬的訓(xùn)成率。

OR 是由嗅覺(jué)細(xì)胞表達(dá)的一種蛋白質(zhì)，OR 基因?qū)儆贕 蛋白偶聯(lián)受體超家族[1]。1991 年， 首先在褐家鼠中發(fā)現(xiàn)OR 基因超家族[2]，闡明了嗅覺(jué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成和工作原理。OR 基因很小， 每一OR 由大約1 kb 單一編碼的外顯子組成，編碼區(qū)沒(méi)有內(nèi)含子。Olender 等[3]研究識(shí)別了犬基因組中1300 個(gè)OR 基因，約占犬OR 基因組的80%。雖然目前科研人員對(duì)犬OR 基因的組成結(jié)構(gòu)、分類(lèi)分布和多態(tài)性等方面展開(kāi)了研究，但很少有人對(duì)犬OR 基因多態(tài)性與其嗅探能力之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行研究。

在本研究工作中，以警用工作犬作為模式動(dòng)物，采用Sequenom MassARRAY SNP 分型技術(shù)，對(duì)OR 基因的68 個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)，并分析不同SNP 基因型與工作犬嗅探能力之間的關(guān)聯(lián)性，來(lái)探索驗(yàn)證犬主效OR 基因SNP 位點(diǎn)，尋找與犬嗅探能力相關(guān)的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

本研究受試對(duì)象是由113只犬組成的群體，為來(lái)自公安部南京警犬研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生產(chǎn)的工作犬以及各市局警犬隊(duì)的1～3 歲的史賓格犬44 只(雄24，雌20)、拉布拉多犬40 只(雄25，雌15)和德國(guó)牧羊犬29 只(雄16，雌13)。這些犬大多是經(jīng)過(guò)實(shí)戰(zhàn)檢驗(yàn)，并且通過(guò)年度復(fù)核的嗅探犬，或者是在某個(gè)特定專(zhuān)業(yè)方向進(jìn)行訓(xùn)練，處于訓(xùn)練最后一個(gè)階段即實(shí)戰(zhàn)驗(yàn)證之前的嗅探犬。所有工作犬全年飼養(yǎng)于戶外，一犬一舍(4 m×4 m)，犬舍屋頂有隔熱層，并有獨(dú)立的戶外運(yùn)動(dòng)場(chǎng)(15 m×6 m)。采用顆粒飼料定時(shí)定量飼喂，自由飲水，每日適度散放、運(yùn)動(dòng)，定時(shí)訓(xùn)練。全程獸醫(yī)監(jiān)控健康保障。帶犬民警和飼養(yǎng)管理人員，按照犬訓(xùn)練使用保障條例以人道的方式對(duì)待所有受試工作犬。

1.2 主要儀器及試劑

2720 型PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；System electrophoresis Mupid (Mupid 2 plus)電泳槽購(gòu)自日本TaKaRa公司； image system(EUV-LDUV)凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自韓國(guó) Biotech公司； Centrifuge (MICRO 17TR)離心機(jī)購(gòu)自韓國(guó)Hanil公司； Agena Mass ARRAY購(gòu)自美國(guó)Agena 公司。血液基因組DNA 提取試劑盒(DP348)和蛋白酶K 購(gòu)自天根生化科技有限公司；PCR Enzyme 購(gòu)自瑞士Roche 公司； PCR Accessory Set、SpectroCHIP Resin Kit 和IPLEX Gold Reagent Kit(Large)均購(gòu)自美國(guó)Agena 公司； 濾膜(0.22 μm)購(gòu)自南京天為生物科技有限公司； 引物由英濰捷基(上海)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 嗅探能力測(cè)試以及評(píng)分 本實(shí)驗(yàn)研究參考文獻(xiàn)[4]測(cè)試方法，結(jié)合公安機(jī)關(guān)使用的警犬專(zhuān)業(yè)考核方法，通過(guò)警犬訓(xùn)導(dǎo)員專(zhuān)業(yè)考核評(píng)分(professional test，PT)和生物本能中性測(cè)試(instinct test，IT)兩種方式，綜合考核受試犬只的嗅探能力。PT 法(百分制)是由具有豐富經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)業(yè)警犬訓(xùn)導(dǎo)員，按照公安部頒發(fā)的緝毒犬、搜爆犬和血跡搜索犬考核方法和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)受試犬只的嗅探能力按百分制進(jìn)行打分。IT 法(五分制)是設(shè)置與專(zhuān)業(yè)方向無(wú)關(guān)的食物氣味的中性測(cè)試方法，利用動(dòng)物覓食的本能，考核工作犬嗅覺(jué)的靈敏性[4]。

最終結(jié)果以這2 種測(cè)試方法的加權(quán)成績(jī)得分(grading score，GS)，確定嗅探能力等級(jí)，GS 越高，則意味著該犬的嗅探能力等級(jí)越高。

加權(quán)公式： GS= PT×0.1×0.5 + IT

1.3.2 血樣采集 由具備資格獸醫(yī)，對(duì)試驗(yàn)犬使用一次性真空抗凝管頸靜脈采血，每只2～5 mL，送至實(shí)驗(yàn)室-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 犬基因組DNA提取與檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢，并測(cè)定濃度和吸光度(A)值， 合格的DNA樣品， A260/A280在1.6～2.0。質(zhì)檢合格的DNA 將濃度調(diào)整到50 ng/μL。

1.3.4 OR 基因SNP 的篩選 本研究根據(jù)前期預(yù)研實(shí)驗(yàn)和參閱相關(guān)文獻(xiàn)[5，6]， 從犬OR 基因超級(jí)家族的SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)中， 挑選出68 個(gè)SNP 位點(diǎn)。挑選原則：(1)具有較高多態(tài)性， 最小等位基因頻率(MAF)＞0.1；(2)考慮到OR基因SNP在犬種分布上的異質(zhì)性，例如某些OR基因在某一犬種中的SNP位點(diǎn)數(shù)目特別多，而在另外一個(gè)犬種的SNP 位點(diǎn)相對(duì)較少，因此重點(diǎn)將文獻(xiàn)[5，6]中所發(fā)現(xiàn)的史賓格犬和拉布拉多犬這2 個(gè)犬種的OR 基因SNP 位點(diǎn)納入范圍(表1)。

表1 挑選的SNP 信息(部分)

1.3.5 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)SNP 的ID 從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，查找所在OR 基因SNP 位點(diǎn)上下游100 bp 參考序列，使用Sequenom公司的引物設(shè)計(jì)軟件Assay design3.1，設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)和單堿基擴(kuò)展引物并合成，引物具體序列信息見(jiàn)表2。

1.3.6 PCR 擴(kuò)增 采用多重PCR 技術(shù)， 在384孔板中進(jìn)行， 每個(gè)反應(yīng)體系總體積為5 μL， 在兼容384孔板的PCR 儀上，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。 PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min； 95 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃60 s，共45 個(gè)循環(huán)； 72 ℃再延伸3 min。

1.3.7 PCR產(chǎn)物堿性磷酸酶處理 在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將配制好的SAP mix 溶液加入384 孔PCR 反應(yīng)板，進(jìn)行堿性磷酸酶處理反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積為7 μL (PCR 產(chǎn)物5 μL，SAP 混合液2 μL)。堿性磷酸酶處理反應(yīng)條件： 37 ℃： 40 min； 85 ℃ 5 min，4 ℃維持。

表2 SNP 引物序列信息(部分)

1.3.8 單堿基延伸 取出反應(yīng)產(chǎn)物，將配制好的Extend mix 對(duì)應(yīng)加入384 孔反應(yīng)板。對(duì)于每個(gè)反應(yīng)孔，單堿基延伸反應(yīng)體系包含SAP 處理后PCR 產(chǎn)物7 μL 及 Extend Mix 液2 μL，總體系9 μL。啟動(dòng)PCR 儀進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。單堿基延伸PCR反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 5 s，(52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，5 個(gè)內(nèi)循環(huán))，再一起40 個(gè)外循環(huán)；72 ℃再延伸3 min。

1.3.9 樹(shù)脂純化 將反應(yīng)產(chǎn)物加16 μL水進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尯笫褂脴?shù)脂進(jìn)行脫鹽。

1.3.10 芯片點(diǎn)樣 沉淀樹(shù)脂后使用MassARRAY Nanodispenser RS1000 點(diǎn)樣儀轉(zhuǎn)移至384 孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，自然結(jié)晶。

1.3.11 質(zhì)譜檢測(cè) 上機(jī)進(jìn)行MALDI-TOF 質(zhì)譜檢測(cè)，并收集數(shù)據(jù)，采用TYPER4.0 軟件(Sequenom)進(jìn)行基因型判讀。

1.4 關(guān)聯(lián)分析

關(guān)聯(lián)分析中， 質(zhì)控主要是評(píng)價(jià)樣本及 SNP 位點(diǎn)性能的操作， 通過(guò)質(zhì)控剔除不符合條件的樣本或 SNP位點(diǎn)可有效降低關(guān)聯(lián)假陽(yáng)性的概率。樣本的質(zhì)控主要包括： 樣本群體結(jié)構(gòu)、雜合度等； SNP 位點(diǎn)的質(zhì)控主要包括： call rate(檢出率)、哈迪溫伯格(H-W)平衡檢驗(yàn)、最小等位基因頻率等。

采用 plink 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 用線性回歸模型， 對(duì)所有合格樣品SNP與對(duì)應(yīng)的工作犬考核評(píng)分，進(jìn)行嗅探能力關(guān)聯(lián)分析： 分析嗅覺(jué)靈敏個(gè)體(GS 高分)和嗅覺(jué)遲鈍個(gè)體(GS 低分)在每個(gè)SNP 位點(diǎn)上基因型和等位基因的差異，尋找與工作犬嗅探能力顯著相關(guān)的SNP 位點(diǎn)。

多重檢驗(yàn)校正一般采用bonferroni (BONF)校正法，校正的方法是P*位點(diǎn)數(shù)。比如我們一共做了20 個(gè)位點(diǎn)，校正后的BONF 值為P*20，結(jié)果仍然＜0.05，這是可以判定為顯著，＜0.01 則為極顯著。BONF 校正方法檢驗(yàn)過(guò)于嚴(yán)格，導(dǎo)致找不到顯著差異的基因位點(diǎn)(假陰性)。而FDR_BH 法，是用一種簡(jiǎn)單好用且比較溫和的方法校正P值，可以在假陽(yáng)性和假陰性間達(dá)到平衡，將假/真陽(yáng)性比例控制到一定范圍之內(nèi)。FDR(假陽(yáng)性率)錯(cuò)誤控制法基本原理是通過(guò)控制FDR值來(lái)決定P值的值域。那么怎么從P 值來(lái)估算FDR 呢，人們?cè)O(shè)計(jì)了幾種不同的估算模型，其中使用最多的是Benjamini and Hochberg 方法，簡(jiǎn)稱(chēng)BH 法。

因此，本研究對(duì)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的P 值，采取了BONF 法和BH 法進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正。

2 結(jié)果

2.1 工作犬嗅探能力考核評(píng)分

嗅探能力綜合考核評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2 SNP 位點(diǎn)檢測(cè)分型

2.2.1 SNP 位點(diǎn)檢出率 68 個(gè)SNP 位點(diǎn)檢出率，數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 工作犬嗅探能力考評(píng)得分情況(部分)

表4 SNP 位點(diǎn)檢出率(部分)

2.2.2 SNP位點(diǎn)基因分型結(jié)果 受試的113只工作犬， 在各個(gè)OR 基因的SNP位點(diǎn)上，均能有效分型。

2.3 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

2.3.1 最小等位基因頻率及H-W平衡檢驗(yàn) 對(duì)所研究的群體進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P＞0.05，說(shuō)明接受零假設(shè)， 即群體滿足H-W 平衡， 反之， 如果P＜0.05， 說(shuō)明群體不滿足H-W 平衡。68 個(gè)SNP 位點(diǎn)經(jīng)質(zhì)控后合格的有52 個(gè)(P＞0.05)，說(shuō)明采樣的犬群滿足H-W平衡，可以進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析研究(表5)。

2.3.2 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 有23 個(gè)SNP 位點(diǎn)與工作犬的嗅探能力有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著相關(guān)(P＜0.05)，其余29 個(gè)SNP 位點(diǎn)的基因型與工作犬嗅探能力顯著不相關(guān)(P＞0.05)，工作犬嗅探能力關(guān)聯(lián)分析情況詳見(jiàn)表6。

經(jīng)過(guò)多重檢驗(yàn)BONF法校正后， COR52AC1_436、rs850523383、CfOR0149_364 和CfOR0055_265 這4個(gè)SNP位點(diǎn)與嗅探能力顯著相關(guān)(P＜0.05)； 經(jīng)過(guò)多重檢驗(yàn)FDR_BH 法校正后，COR52AC1_436、rs850523383、CfOR0149_364 和CfOR0055_265 這4 個(gè)SNP 位點(diǎn)與嗅探能力極顯著相關(guān)(P＜0.01)。

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的建立

本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)應(yīng)用設(shè)計(jì)軟件Assay design3.1，設(shè)計(jì)PCR 反應(yīng)和單堿基擴(kuò)展引物，對(duì)引物濃度、堿性磷酸酶處理反應(yīng)液(SAP Mix)、單堿基延伸反應(yīng)液(EXTEND Mix)退火溫度、模板量等進(jìn)行優(yōu)化，成功篩選出68 組特異性好、靈敏度更高的引物， 結(jié)果表明， 建立的Sequenom MassARRAY SNP檢測(cè)OR 基因分型技術(shù)方法， 68 個(gè)SNP 位點(diǎn)在在史賓格犬、拉布拉多犬和德國(guó)牧羊犬3 個(gè)犬種中檢出率在90%以上，說(shuō)明該方法可以有效應(yīng)用于這3個(gè)犬種的OR 基因SNP 分型。

3.2 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果校正

本研究對(duì)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的P值，采取了BONF法和BH 法進(jìn)行了多重檢驗(yàn)校正，均發(fā)現(xiàn)有同樣的4 個(gè)SNP位點(diǎn)與嗅探能力相關(guān)，只是顯著程度有所區(qū)別，說(shuō)明COR52AC1_436、rs850523383、CfOR0149_364 和CfOR0055_265 這4 個(gè)SNP位點(diǎn)，可以作為建立嗅探能力分子檢測(cè)方法的首選位點(diǎn)。

3.3 OR 基因與犬嗅探能力的研究

Anna 等[4]曾挑選了5 個(gè)OR 基因， 試圖探究OR基因與警犬嗅探能力之間的關(guān)系， 結(jié)果檢測(cè)到18個(gè)SNPs， 其中cOR52N9_176 和cOR9S13_592 這2 個(gè)基因顯著影響嗅探犬的檢測(cè)能力。 Yang等[7]曾應(yīng)用Beckman Genome-Lab SNP stream 技術(shù)，選擇了OR 基因的22 個(gè)SNP 位點(diǎn)，試圖探究其與德國(guó)牧羊犬嗅探能力之間的關(guān)系， 結(jié)果顯示，OR10H1-like 632C＞T、OR10H1-like 770A＞T、OR2K2-like 518G＞A、 OR4C11-like 511T＞G 和OR4C11-like 692G＞A 這5 個(gè)SNP 位點(diǎn)可能極顯著影響德國(guó)牧羊犬嗅探能力。

表5 基因頻率及H-W 平衡檢驗(yàn)情況(部分)

表6 工作犬嗅探能力關(guān)聯(lián)分析情況(部分)

而本研究篩選了OR基因的68個(gè)SNP位點(diǎn)，應(yīng)用Sequenom MassARRAY SNP 技術(shù)對(duì)史賓格犬、拉布拉多犬和德國(guó)牧羊犬這3個(gè)品種工作犬OR基因的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行基因分型檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與工作犬的嗅探能力呈一般統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著相關(guān)(P＜0.05)的SNP位點(diǎn)有23個(gè)， 其中經(jīng)過(guò)多重檢驗(yàn)校正后，發(fā)現(xiàn)COR52AC1_436、rs850523383、CfOR0149_364和CfOR0055_265 這4 個(gè)SNP 位點(diǎn)與這3 個(gè)品種工作犬嗅探能力顯著相關(guān)，這4 個(gè)SNP位點(diǎn)是國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)。本研究較Anna 等[4]和Yang 等[7]研究篩選的SNP 數(shù)量更多，發(fā)現(xiàn)的與工作犬嗅探能力顯著相關(guān)的SNP 位點(diǎn)適應(yīng)的品種更為豐富，為工作犬嗅探能力相關(guān)基因的輔助育種提供了候選標(biāo)記。

綜上所述， 本研究篩選出與工作犬嗅探氣味能力相關(guān)聯(lián)的主效OR 基因SNP 位點(diǎn)4 個(gè)， 初步建立了一種能適用于鑒定史賓格犬、拉布拉多犬和德國(guó)牧羊犬等3個(gè)工作犬種嗅探能力的分子遺傳學(xué)檢測(cè)方法。該方法可應(yīng)用于選種選育， 促進(jìn)精準(zhǔn)育種； 也可以用于選擇嗅探能力優(yōu)秀的合格受訓(xùn)犬， 節(jié)省人力物力和訓(xùn)練時(shí)間， 提升警犬訓(xùn)練和實(shí)戰(zhàn)使用的效果。