王赟 鮑靖
肺結(jié)核是我國常見的傳染病之一,臨床常采用多種抗結(jié)核藥物治療,但患者易出現(xiàn)抗結(jié)核急性藥物性肝損傷(anti-tuberculosis acute drug-induced liver injury,AADLI),嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患者出現(xiàn)急性肝衰竭甚至死亡[1]。目前關(guān)于AADLI的誘因尚未完全清楚,有研究認(rèn)為與藥物毒性代謝酶及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的基因多態(tài)性有關(guān)[2]。谷氨酰半胱氨酸連接酶修飾亞基(GCLM)基因C-588T位點(diǎn)多態(tài)性可影響GCLM活性進(jìn)而參與多種生理病理過程[3],谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)T-129C位點(diǎn)可通過影響抗氧化物水平進(jìn)而參與慢阻肺疾病發(fā)生及發(fā)展過程[4],谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)可促使親電子物質(zhì)與谷胱甘肽繼而與親脂性細(xì)胞毒藥物結(jié)合并降低藥物作用[5]。本研究主要探討GCLM、GCLC、GSTP1基因多態(tài)性與AADLI的關(guān)系,為臨床用藥和降低肝損傷發(fā)生率提供參考。
選取2016年6月至2017年2月在青海省第四人民醫(yī)院確診為肺結(jié)核患者178例,所有肺結(jié)核患者均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。出現(xiàn)抗結(jié)核急性藥物性肝損傷患者92例為研究組,均符合抗結(jié)核藥物性肝損傷診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],其中男68例,女24例,年齡42~68歲,平均(49.2±15.8)歲。未出現(xiàn)抗結(jié)核急性藥物性肝損傷患者86例為對照組,其中男56例,女30例,年齡41~70歲,平均(48.7±16.6)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn):①抗結(jié)核治療不少于6個(gè)月;②均使用相同抗結(jié)核治療方案;③無服用其他可引起肝功能異常藥品;④臨床資料完整;⑤患者知情且簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①其他原因所致肝功能嚴(yán)重?fù)p傷;②病毒性肝炎或酒精性肝炎;③自身免疫性疾??;④患者依從性差;⑤多種組織器官缺氧性損傷。
采集受試者靜脈血3 mL置于EP抗凝管內(nèi),2 000 r/min離心3 min,加入紅細(xì)胞裂解液混勻,-20 ℃保存。提取基因組DNA并采用限制性片段長度多肽法(RFLP)進(jìn)行檢測,DNA提取試劑盒(購自北京天根生化科技公司)提取全血基因組DNA,GCLM、GCLC、GSTP1基因分型采用PCR結(jié)合RFLP方法并運(yùn)用Sequenom軟件進(jìn)行SNP基因分型(Nano Drop2000c核酸檢測儀購于美國Thermo公司,PCR擴(kuò)增儀購自美國BioRad公司),GCLM基因T-588C、GCLC基因C-129T位點(diǎn)T、GSTP1基因Ile105Val位點(diǎn)PCR擴(kuò)增、單堿基延伸引物由廣州Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)體系共50 μl,Taq Buffer 5 μl,MgCl23 μl,位點(diǎn)T、G(A、C)引物上下游各2 μl,dNTP Mix 1 μl,DNA樣本4 μl,Taq DNA 0.5 μl,H2O 28.5 μl。PCR反應(yīng)條件為95℃ 53 min,95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,共35個(gè)循環(huán),72℃延伸7 min。取PCR產(chǎn)物5 μl并加入20 μl酶切反應(yīng)體系,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶,各基因型判斷參照相關(guān)文獻(xiàn)[8],回收PCR產(chǎn)物經(jīng)上海生工生物公司進(jìn)行序列測定。GCLM基因T-588C位點(diǎn):①野生型CC型,兩條DNA條帶,200 bp、84 bp;②突變雜合子CT型,兩條DNA條帶,200 bp、129 bp;③突變純合子TT型,一條DNA條帶,129 bp。GCLC基因C-129T位點(diǎn):①野生型純合子TT型,一條DNA條帶,163 bp;②突變雜合子CT型,兩條DNA條帶,163 bp、137 bp;③突變純合子CC型,一條DNA條帶,137 bp。GSTP1基因Ile105Val位點(diǎn):①野生型純合子AA型,一條DNA條帶,452 bp;②突變雜合子AG型,兩條DNA條帶,452 bp、222 bp;③突變純合子GG型,兩條DNA條帶,230 bp、222 bp。
ALT、AST、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)、TBil、白蛋白、血清C反應(yīng)蛋白(CRP)。
研究組ALT、AST、γ-GT、TBil與CRP水平均顯著高于對照組(P<0.05),而白蛋白水平顯著低于對照組(P<0.05),見表1。
表1 2組患者肝功能指標(biāo)比較(±s)
GCLM、GCLC與GSTP1電泳條帶結(jié)果見圖1。GCLM基因T-588C位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)性即C→T,CC為野生型、CT為突變雜合子、TT為突變純合子;GCLC基因C-129T位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)性即T→C,TT為野生型、CT為突變雜合子、CC為突變純合子;GSTP1基因Ile105Val位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)性即A→G,AA為野生型、AG為突變雜合子、GG為突變純合子。
注:1-3分別為GCLM基因T-588C位點(diǎn)CC、CT、TT基因型;4-6分別為GCLC基因C-129T位點(diǎn)TT、CT、CC基因型;7-9分別為GSTP1基因Ile105Val位點(diǎn)AA、AG、GG基因型
研究組與對照組Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)結(jié)果顯示GCLM、GCLC與GSTP1基因位點(diǎn)實(shí)際值與預(yù)測值比較無明顯差異(P>0.05),且各基因型頻率穩(wěn)定,符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律,見表2。
四、AADLI與GCLM、GCLC、GSTP1基因多態(tài)性及其相關(guān)因素的Logistic分析
將影響AADLI發(fā)生的影響因素與GCLM、GCLC、GSTP1基因多態(tài)性進(jìn)行Logistic分析,結(jié)果顯示γ-GT、CRP水平及GCLM基因T-588C位點(diǎn)TT、GCLC基因C-129T位點(diǎn)CC、GSTP1基因Ile105Val位點(diǎn)GG基因型均為AADLI發(fā)生的危險(xiǎn)因素,見表3。
藥物性肝損傷主要是由于抗結(jié)核治療藥物及其代謝產(chǎn)物對肝細(xì)胞代謝產(chǎn)生干擾作用,并對肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性及免疫變態(tài)反應(yīng),同時(shí)可對患者抗氧化應(yīng)激能力產(chǎn)生重要影響,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患者出現(xiàn)AADLI甚至危及生命[9]。研究發(fā)現(xiàn)HBV攜帶者發(fā)生藥物性肝損傷的概率更高,并促使藥物清除率降低進(jìn)而加劇藥物毒性反應(yīng)[10]。近年來抗結(jié)核藥物所致肝損傷已成為我國AADLI發(fā)生的主要因素,及時(shí)干預(yù)是減少其發(fā)生的關(guān)鍵[11]。
表2 GCLM、GCLC、GSTP1基因型頻率實(shí)際值與預(yù)測值的比較 [例(%)]
注:a為研究組比較;b為對照組比較
表3 AADLI與GCLM、GCLC、GSTP1基因多態(tài)性及其相關(guān)因素的Logistic分析
谷胱甘肽(GSH)可調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)進(jìn)而降低機(jī)體氧化損傷程度,而谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCL)為GSH的限速酶并對其合成過程產(chǎn)生重要作用[12]。GCL主要由GCLC與GCLM組成,其中GCLC具有催化活性而GCLM具有調(diào)節(jié)功能[13]。研究表明GCLC與GCLM基因單核苷酸多態(tài)性改變可調(diào)控基因表達(dá)過程從而參與多種疾病的發(fā)生過程[14]。GCLM(T-588C)突變基因型可決定啟動(dòng)子活性,并與慢性阻塞性肺疾病易感性密切相關(guān)[15]。GCLC(C-129T)突變基因可通過改變核蛋白結(jié)合域構(gòu)象并阻礙氧化應(yīng)激或免疫反應(yīng)等元件與其結(jié)合進(jìn)而抑制GCLC基因表達(dá),同時(shí)可減少GSH生成并削弱細(xì)胞抗氧化應(yīng)激或免疫能力最終增加發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[16]。本研究結(jié)果顯示,GCLM、GCLC基因位點(diǎn)實(shí)際值與預(yù)測值比較無明顯差異且各基因型頻率穩(wěn)定,符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律,GCLM基因T-588C位點(diǎn)C→T,GCLC基因C-129T位點(diǎn)T→C。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)研究組與對照組GCLM基因T-588C位點(diǎn)TT基因型分布比較差異顯著,GCLC基因C-129T位點(diǎn)CC基因型分布比較差異顯著,說明GCLM基因T-588C位點(diǎn)TT基因型與GCLC基因C-129T位點(diǎn)CC基因型可抑制GCLM及GCLC基因表達(dá)并參與AADLI發(fā)生過程,提示GCLM與GCLC基因多態(tài)性可通過調(diào)控相關(guān)基因表達(dá),并影響GSH生成進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)等生理病理過程,最終影響AADLI發(fā)生及發(fā)展。
谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)是人體內(nèi)一種重要的Ⅱ相藥物代謝酶且屬于解毒酶系,其基因多態(tài)性可通過改變酶分子結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)水平從而影響細(xì)胞解毒能力,其與腫瘤易感性密切相關(guān)[17]。GSTP1基因定位于人類染色體11q13,GSTP1基因Vall05位點(diǎn)A→G突變可影響GSTP1酶活性并與非小細(xì)胞癌藥物化療效果有關(guān)[18]。GSTP1 Ile105Val位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與肺癌、乳腺癌等易感性密切相關(guān)并可影響多種化療藥物敏感性[19]。本研究結(jié)果顯示,GSTP1基因Ile105Val位點(diǎn)主要以AA純合子為主,突變純合子GG基因型較少,但僅GG基因型在研究組與對照組中分布差異顯著,與文獻(xiàn)報(bào)道相似[20]。說明GSTP1 Ile105Val基因型突變可影響肺結(jié)核患者發(fā)生AADLI,提示攜帶GG基因型肺結(jié)核患者發(fā)生AADLI危險(xiǎn)性增加。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,γ-GT、CRP水平及GCLM基因T-588C位點(diǎn)TT基因型、GCLC基因C-129T位點(diǎn)CC基因型、GSTP1基因Ile105Val位點(diǎn)GG基因型均為AADLI發(fā)生的危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果揭示GCLM基因T-588C、GCLC基因C-129T及GSTP1基因Ile105Val位點(diǎn)突變會(huì)影響GSH與GCL活性,降低代謝藥物能力,進(jìn)而增加AADLI患者易感性。
綜上所述,GCLM、GCLC與GSTP1基因多態(tài)性與AADLI發(fā)生密切相關(guān),可能作為早期AADLI發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo),但其在AADLI發(fā)病過程中的具體作用機(jī)制有待深入研究。