王云檢 尤國(guó)華 張珉 張璐陽

肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率超過60%，成為肝癌患者死亡的主要原因[1]。侵襲與遷移是肝癌的基本特征，細(xì)胞侵襲與遷移取決于細(xì)胞黏附以及細(xì)胞外蛋白水解變性[2]。肝癌細(xì)胞可以在趨化因子刺激下發(fā)生運(yùn)動(dòng)，但其黏附性程度下降，容易從原發(fā)灶脫離并降解細(xì)胞外基質(zhì)，形成向外轉(zhuǎn)移的通道，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移[3]。sushi重復(fù)蛋白X連鎖2(sushi repeat containing protein x linked 2，SRPX2)是一種硫酸軟骨素蛋白聚糖，與腫瘤的侵襲與遷移密切相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SRPX2的表達(dá)受到抑制，可以減緩肝癌細(xì)胞的侵襲與遷移[5]。因此，通過研究SRPX2對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC97H侵襲與遷移能力的影響及作用機(jī)制，為SRPX2成為肝癌治療靶點(diǎn)提供一定依據(jù)。

資料和方法

一、主要試劑與儀器

人肝癌細(xì)胞MHCC97H(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫，中國(guó))、SRPX2特異性siRNA和陰性對(duì)照(negative control，NC)(上海吉瑪生物科技有限公司，中國(guó))。DMEM 培養(yǎng)基、胰酶(Gibco公司，美國(guó))、胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司，中國(guó))。Trizol Reagent RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連Takara公司，中國(guó))、UltraSYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司，中國(guó))。PCR引物序列(大連Takara公司，中國(guó))為SRPX2引物序列：上游引物為5′-ACTGGATTTGCGGCATGTGA-3′，下游引物為：5′-CCATGTTGAAGTAGGAGCG-AGTGA-3′；MMP-2引物序列：上游引物為5′-AGACATACATCTTTGCTGGAGACA-3′，下游引物為：5′-CTTGAAGAAGTAGCTGTGACCG-3′；GAPDH引物序列：上游引物為5′-TCCCATCACC-ATCTTCCAG-3′，下游引物為：5′- GGTATCC-ATCGCCATGCTC -3′。細(xì)胞蛋白抽提試劑(碧云天生物技術(shù)研究所，中國(guó))、鼠抗SRPX2、MMP-2(Santa Cruz公司，美國(guó))、辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗小鼠IgG二抗、鼠抗GADPH單克隆抗體(武漢艾美捷科技有限公司，中國(guó))。凝膠成像儀(美國(guó) UVP 公司)、ECL 顯影液(美國(guó) Millipore 公司) 。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 (Thermo Revco，美國(guó))、24孔Transwell小室(CORNING科技有限公司，美國(guó))。NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測(cè)儀(Thermo公司，美國(guó))、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BIO-RAD公司，美國(guó))、倒置顯微鏡(Nikon公司，日本)、基質(zhì)膠、BIO-RAD 垂直電泳儀(BD公司，美國(guó))、凝膠成像儀( UVP 公司，美國(guó)) 。

二、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞MHCC97H，條件為37℃、5% CO2，隔天換液，當(dāng)人肝癌細(xì)胞HepG2處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和干擾SRPX2組。空白對(duì)照組在鋪板后48 h收獲細(xì)胞，陰性對(duì)照組和干擾SRPX2組分別用Lipofectamine法將NC和SRPX2特異性siRNA轉(zhuǎn)染到人肝細(xì)胞癌MHCC97H，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收獲細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

三、細(xì)胞體外侵襲和遷移能力實(shí)驗(yàn)

按照細(xì)胞分組分別處理24 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，用基質(zhì)膠檢測(cè)侵襲能力和不鋪基質(zhì)膠檢測(cè)遷移能力。將消化獲得細(xì)胞調(diào)整濃度為5×105后接種在24孔Transwell小室中，每孔200 μl，下室加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出小室，用無菌棉簽擦拭去除上室內(nèi)的細(xì)胞，用4%甲醛固定10 min，用0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min，沖洗干凈后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，拍照。計(jì)數(shù)紫色染色的穿膜細(xì)胞，即細(xì)胞侵襲和遷移能力。各劑量組設(shè)3個(gè)平行樣。

四、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)SRPX2和MMP-2 mRNA的表達(dá)

按照細(xì)胞分組分別處理48 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，消化后取5 mL細(xì)胞液(細(xì)胞濃度為5×106/mL)，5000 r/min、5 min離心，根據(jù)RNA提取試劑盒操作說明書進(jìn)行總 RNA提取，測(cè)定mRNA濃度和純度，將提取的總RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ熒光定量PCR試劑盒說明，用制備20 μl反應(yīng)體系，在CFX-96 PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 30 s、 變性 95℃ 5 s、60℃ 44 s、40個(gè)循環(huán)，61 ℃時(shí)采集熒光，用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀檢測(cè)對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行結(jié)果分析，以GADPH作為內(nèi)參，采用 2-△△Ct法計(jì)算 SRPX2和MMP-2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。各劑量組設(shè)3個(gè)平行樣。

五、Western Blot法檢測(cè)SRPX2和MMP-2蛋白水平

按照細(xì)胞分組分別處理48 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，消化后加2 ml無血清培養(yǎng)基終止消化，5 000 r/min、5 min離心，洗滌2次，加入1 μl PMSF，根據(jù)細(xì)胞量加入胞蛋白抽提液，冰浴2 h；4℃、10 000 r/min、15 min，取上清，進(jìn)行蛋白定量；調(diào)整蛋白濃度，加入1/5體積的5×緩沖液，沸水進(jìn)行變性，-80℃保存?zhèn)溆?。采?BIO-RAD 濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)SDS-PAGE 膠進(jìn)行電泳、切膠；孵育一抗、 4℃下孵育相應(yīng)條帶過夜、孵育相對(duì)于二抗，于暗室內(nèi)用ECL 法發(fā)光觀察蛋白表達(dá)，采集圖像，用凝膠成像儀對(duì)免疫印跡條帶灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值。各劑量組設(shè)3個(gè)平行樣。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人肝癌細(xì)胞MHCC97H侵襲和遷移能力變化

由圖1～2可見陰性對(duì)照組MHCC97H侵襲和遷移能力與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，干擾SRPX2組人肝癌細(xì)胞MHCC97H侵襲和遷移能力較陰性對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 人肝癌細(xì)胞MHCC97H侵襲情況

圖2 人肝癌細(xì)胞MHCC97H遷移情況

二、人肝癌細(xì)胞MHCC97H內(nèi)SRPX2和MMP-2 mRNA表達(dá)的影響

由表1可見陰性對(duì)照組人肝癌細(xì)胞MHCC97H SRPX2和MMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組比較降低不顯著，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，干擾SRPX2組人肝癌細(xì)胞MHCC97H SRPX2和MMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量較陰性對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 人肝癌細(xì)胞MHCC97H內(nèi)SRPX2和MMP-2 mRNA表達(dá)的影響(±s)

注：*表示與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；#與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

三、人肝癌細(xì)胞MHCC97H內(nèi)SRPX2和MMP-2蛋白表達(dá)的影響

由圖3可見陰性對(duì)照組人肝癌細(xì)胞MHCC97H SRPX2和MMP-2蛋白表達(dá)量較空白對(duì)照組降低不顯著，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，干擾SRPX2組人肝癌細(xì)胞MHCC97H SRPX2和MMP-2 蛋白表達(dá)量較陰性對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A:空白對(duì)照組、B:陰性對(duì)照組、C:干擾SRPX2組

討 論

SRPX2最先在癌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在正常組織中均有低表達(dá)[6]。在對(duì)結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，SRPX2在癌癥組織中高表達(dá)，且與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，提示SRPX2 蛋白在癌癥組織中高表達(dá)[7]。SRPX2可以和組織蛋白酶B、半胱氨酸蛋白酶及金屬蛋白酶等結(jié)合，影響細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白的水解,而 ECM 結(jié)構(gòu)的改變是影響細(xì)胞侵襲遷移的重要因素之一[7]。RNA 干擾(RNAinterference,RNAi)是基因轉(zhuǎn)錄后沉默的重要機(jī)制之一，通過破壞靶基因的mRNA使其基因不表達(dá)，siRNA是RNAi的效應(yīng)分子。本研究發(fā)現(xiàn)，通過將SRPX2特異性siRNA干擾片段轉(zhuǎn)入人肝癌細(xì)胞MHCC97H后，SRPX2 mRNA和蛋白的表達(dá)量都降低，同時(shí)使MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)量也降低。MMP2是MMP家族的重要一員，MMP家族成員幾乎都能降解ECM中的各種蛋白成分，MMP-2基因5′旁側(cè)序列促進(jìn)子區(qū)域含有2個(gè)GC盒，活化的MMP-2定位于細(xì)胞穿透基質(zhì)的突出部位，在酶解細(xì)胞間基質(zhì)成分及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原中有“鉆頭”的作用，是ECM代謝過程中最主要的蛋白水解酶類。在裸鼠肝癌模型的研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2的表達(dá)量增加可以影響肝癌細(xì)胞的輕型遷移能力，增加了肝癌細(xì)胞向裸鼠肺部轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)；同時(shí)，門靜脈受到侵犯是肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，MMP-2可以破壞狄氏間隙的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，為肝癌細(xì)胞的遷移創(chuàng)造了條件[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過干擾SRPX2表達(dá)，進(jìn)而使MMP-2的表達(dá)降低，人肝癌細(xì)胞MHCC97H侵襲和遷移能力降低。

綜上所述，SRPX2與肝癌細(xì)胞的侵襲遷移密切相關(guān)，SRPX2的表達(dá)降低，MMP2的表達(dá)也隨之降低，其侵襲遷移能力也明顯下降，SRPX2可能通過調(diào)節(jié)MMP2而影響人肝癌細(xì)胞MHCC97H侵襲和遷移，為肝癌靶向治療提供一定的理論依據(jù)。