孟盈，楊建宇，歐陽春，黃元姣

（廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021）

0 引言

鼻咽癌是我國常見惡性腫瘤之一，根據(jù)國際癌癥研究所（IARC）數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，中國鼻咽癌發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平[1]，且鼻咽癌預(yù)后相對較差，生存率相對較低，多發(fā)于我國兩廣地區(qū)。S100A8蛋白是鈣結(jié)合蛋白S100蛋白家族的主要成員，常與S100A9蛋白以鈣離子依賴的方式形成異源二聚體發(fā)揮作用，參與炎癥反應(yīng)。近年來研究表明S100A8/A9在具有促進腫瘤細胞侵襲、遷移以及凋亡的作用，有可能成為腫瘤治療的新靶點，具有非常廣闊的研究前景[2]。根據(jù)本課題組前期研究，S100A8/A9蛋白對人鼻咽癌低分化細胞系CNE2的侵襲遷移有促進作用[13]，因此，本實驗采用CRISPRCas9技術(shù)對CNE2細胞的S100A8基因進行敲除，為研究S100A8基因在鼻咽癌細胞的侵襲遷移及作用機制提供有效的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 細胞株、慢病毒、質(zhì)粒及菌株

人鼻咽癌低分化細胞系CNE2購于湘雅中心實驗室細胞庫；LentiCas9-Blasticidin慢病毒購于吉滿生物科技（上海）有限公司；LentiGuide-Puro質(zhì)粒購于美國Adgene公司（www.adgene.com）；感受態(tài)大腸桿菌Stbl3購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑

RPMI-1640、0.25%-E D胰 T A酶和胎牛血清（Biological Industries公司）；Cell Counting Kit 8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本 Takara 公司）；Fast Start Universal SYBR Green Master（德國Roche公司）；GAPDH山羊抗兔一抗、Cas9蛋白山羊抗鼠一抗、HR P-抗兔IgG均購自美國CST公司，S100A8山羊抗兔一抗購自美國Abcam公司，HRP-抗鼠IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 基因測序與引物序列合成

本實驗所需的引物、gRNA序列均合成于華大基因，序列測序有生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 繪制細胞生長抑制曲線

取對數(shù)生長期的CNE2細胞，制成單細胞懸液，以5000個/孔的密度接種在96孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁12h后，將培養(yǎng)基分別替換為含殺稻瘟菌素（Blasticidin）0.5、1、2、4、6、8、10μg/mL 的完全培養(yǎng)基100μl，對照組加入等體積的不含殺稻瘟菌素（Blasticidin）的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔。置于5%CO2、37℃飽和濕度下培養(yǎng)48h后，吸出含藥培養(yǎng)基，PBS沖洗后，每孔加入100μl RPMI 1640培養(yǎng)基與10μL CCK-8孵育120min，于450nm測定其吸光度（A）值，根據(jù)公式計算抑制率。

抑制率=1-A加藥/A對照1.4.2 慢病毒轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的CNE2細胞，制成單細胞懸液，以3500個/孔的密度接種在69孔培養(yǎng)板中，細胞貼壁12h后，按照MOI=30，用含慢病毒的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染細胞（病毒滴度為＞107TU/mL），同時加入適量的Polybrene助轉(zhuǎn)試劑。感染后72h棄含病毒的培養(yǎng)基，更換為含殺稻瘟菌素4μg/mL的培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后，棄含殺稻瘟菌素的培養(yǎng)基，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，至細胞覆蓋整個孔底，將細胞轉(zhuǎn)至25T細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。

1.4.3 qRT-PCR檢測Cas9蛋白表達情況

收集長勢良好且鋪滿細胞培養(yǎng)瓶瓶底95%的已轉(zhuǎn)染的細胞，取未轉(zhuǎn)染的細胞做對照組。提取細胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用表中所示引物進行熒光定量分析，反映程序為95℃預(yù)變性10min；95℃15s；60℃ 1min；循環(huán)40次。每組設(shè)3個復(fù)孔，采用2-△△Ct計算目的基因mRNA相對水平。見表1。

1.4.4 Western Blot驗證Cas9蛋白表達情況

收集長勢良好且鋪滿瓶底95%的細胞，取未轉(zhuǎn)染的細胞做對照組。各組用冷PBS沖洗3次離心，加入細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑、EDTA、PSFM），置于冰上裂解30min后，收集于離心管，低溫離心后取上清懸液，稀釋30倍后用BCA試劑盒測定蛋白濃度，取30μg，按照正常步驟做Western blotting實驗。用雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描并觀察結(jié)果。

1.4.5 gRNA的設(shè)計與合成

根據(jù)S100A8的基因序列（NC_000001.11），利用在線gRNA設(shè)計網(wǎng)站（http://www.chopchop.cbu.uib.no/）設(shè)計針對S100A8基因的gRNA，引物序列如表2所示。在正義鏈模板的5‘端添加CACCG，反義鏈模板的5’端添加AAAC，使其可與BsmbI酶切后形成的粘性末端互補。將合成好的gRNA經(jīng)過磷酸化、退火后形成雙鏈DNA。見表2。

1.4.6 載體構(gòu)建

將Lentiguide-Puro空質(zhì)粒載體用限制性內(nèi)切酶BsmbI進行酶切后產(chǎn)生一長（約9000bp）一短（約2200bp）兩條片段，通過1%瓊脂糖凝膠電泳，回收較長酶切產(chǎn)物。通過T4連接酶將退火磷酸化后的gRNA產(chǎn)物與酶切回收產(chǎn)物連接得到連接產(chǎn)物。通過熱擊法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入stbl3感受態(tài)細胞中進行轉(zhuǎn)化，將加入連接產(chǎn)物的感受態(tài)細胞均勻混入不含抗生素的LB培養(yǎng)基中，200rpm/min搖菌1h后，3000g離心2min，棄部分上清，保留100μl培養(yǎng)基，輕柔混勻后涂布于含2%氨芐青霉素的平板中篩選。24h后挑取5～6個長出的單克隆，搖菌16小時后，取800μl菌液凍存， 500μl用于進一步測序鑒定，測序引物為U6通用引物。其余菌液提取質(zhì)粒后凍存。

1.4.7 CNE2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染過病毒的CNE 2細胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的1640培養(yǎng)基進行常規(guī)細胞培養(yǎng)。于24孔板中每孔接種1.5X105個細胞，待細胞密度達到60%-70%時進行轉(zhuǎn)染。以等量空白載體Lentiguide-Puro為陰性對照。轉(zhuǎn)染前30min更換為無雙抗的培養(yǎng)基，每孔加750μl培養(yǎng)基（10%FBS+1640）。取一1.5mLEP管標(biāo)記為1號，取重組質(zhì)粒 2μg，稀釋到 100μL Opti-MEM中，靜置5min；另取一1.5mLEP管標(biāo)記為2號，取4μl LP3000，稀釋到100μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中。將2號管中的液體吸至1號管中，混勻，室溫靜置20min。等待的20min中將24孔細胞培養(yǎng)板取出，將培養(yǎng)基換成含有10%FBS的培養(yǎng)基。將1號管中的混合液體迅速加入到準(zhǔn)備好的24孔板細胞中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后將培養(yǎng)基更換為含嘌呤霉素（10μg/mL）和10%FBS的培養(yǎng)基進行篩選。同時用等量的LentiGuide-Puro空白質(zhì)粒做陰性對照。

表1 引物序列信息

表2 gRNA序列信息

1.4.8 敲除S100A8基因的CNE2細胞單克隆篩選及鑒定

更換培養(yǎng)基后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，直至細胞融合度達到80%以上。將轉(zhuǎn)染的細胞通過稀釋至80個細胞/mL，然后接種到96孔板上，100μL/孔。顯微鏡下觀察并標(biāo)記只有一個細胞的孔，每天觀察其生長狀態(tài)。待到其細胞融合度達到80%-90%后，將細胞轉(zhuǎn)移至24孔板培養(yǎng)3-5天，待其細胞融合度達到80%以上后，將其轉(zhuǎn)至T25細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。取部分細胞提取蛋白進行Western Blot實驗檢測細胞的S100A8蛋白是否表達，從而判斷S100A8基因是否敲除成功。

2 結(jié)果

2.1 抑制率曲線繪制

分別將不同濃度的殺稻瘟菌素作用于CNE2細胞，檢測其濃度在0.5、1、2、4、6、8、10μg/mL時對細胞的抑制率。如圖1所示，當(dāng)藥物濃度為1μg/mL時，細胞增殖抑制率達到95%，因此后續(xù)篩選濃度選擇 2μg/mL。

圖1 殺稻瘟菌素對CNE2生長的抑制作用

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果驗證

正常細胞內(nèi)Cas9蛋白幾乎無表達，慢病毒轉(zhuǎn)染成功后細胞才可以表達Cas9蛋白，經(jīng)過RT-PCR檢測，轉(zhuǎn)染后的細胞內(nèi)Cas9蛋白表達量明顯高于對照組，如圖2。因此可在基因?qū)用孀C明已成功構(gòu)建可表達Cas9蛋白的CNE2細胞株。

圖2 轉(zhuǎn)染后CNE2細胞內(nèi)Cas9蛋白表達情況

2.3 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后CNE2細胞的Cas9蛋白表達情況

進一步從蛋白水平進行驗證。如圖3，與未進行轉(zhuǎn)染的CNE2細胞相比，轉(zhuǎn)染后的CNE2細胞檢測到Cas9蛋白表達，說明轉(zhuǎn)染成功。

圖3 A：Westernblot檢測細胞株中Cas9蛋白表達情況；B：細胞株中Cas9蛋白表達灰度值

2.4 Lentiguide-Puro-S100A8-sg載體構(gòu)建后的驗證

如圖4所示，測序結(jié)果顯示，靶向S100A8基因的gRNA序列成功連入Lentiguide-Puro載體，證明Lentiguide-Puro-sg載體構(gòu)建成功。

圖4 編輯S100A8基因的Lentiguide-Puro-S100A8-sg質(zhì)粒載體測序結(jié)果

2.5 S100A8基因敲除驗證

分別與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的CNE2細胞系、只轉(zhuǎn)染慢病毒的CNE2細胞系、轉(zhuǎn)染慢病毒與空白質(zhì)粒的CNE2細胞系比較，轉(zhuǎn)染慢病毒與攜帶sgRNA的質(zhì)粒的CNE2細胞系不表達S100A8蛋白，說明S100A8基因敲除成功。見圖5。

CNE2-T: 只轉(zhuǎn)染病毒的CNE2細胞；CNE2-LG：轉(zhuǎn)染病毒與空白質(zhì)粒的CNE2細胞；CNE2-sg: 轉(zhuǎn)染慢病毒與gRNA質(zhì)粒的CNE2細胞圖5 A: Westernblot檢測細胞株中S100A8蛋白的表達情況；B：細胞株中S100A8蛋白表達灰度值

3 討論

S100A8（calgranulin，MRP8）是鈣離子結(jié)合蛋白S100蛋白家族的成員之一，通常與S100A9通過化學(xué)結(jié)合形成異源二聚體從而發(fā)揮作用。研究表明，S100A8/A9具有抗炎作用，在炎癥反應(yīng)中，S100A8易被氧化從而消耗部分氧化物，可保護組織不被氧化，發(fā)揮抗炎作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，S100A8/A9在某些惡性腫瘤中表達上調(diào)，促進腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及浸潤，如結(jié)直腸癌、胃癌等[4,5]。

CRISPR-Cas9是一項近年來興起的基因編輯技術(shù)，可以對基因組進行精準(zhǔn)、高效的敲除[6]。它通過gRNA與Cas9核酸酶識別不同的外源DNA序列，進而對其進行切割，使斷裂后的DNA進行插入缺失、修復(fù)或者替換[7-11]。我們發(fā)現(xiàn)，S100A8蛋白和S100A9蛋白在鼻咽癌患者血漿、鼻咽癌組織以及培養(yǎng)細胞中表達水平均高于正常人[12]，研究表明，通過siRNA沉默S100A8、S100A9基因后，鼻咽癌細胞的侵襲遷移能力受到影響[13]。

本實驗采用CRISPR-Cas9技術(shù)，對鼻咽癌低分化CNE2細胞系S100A8基因進行切割，使得S100A8基因雙鏈斷裂后形成錯配，從而達到敲除S100A8基因的目的。通過慢病毒轉(zhuǎn)染，首先使CNE2細胞可以穩(wěn)定表達Cas9蛋白。通過Westernblot與RT-PCR結(jié)果可以看出，經(jīng)過轉(zhuǎn)染，CNE2細胞已可以穩(wěn)定表達Cas9蛋白。通過測序結(jié)果可以看到，gRNA已成功連接到Lentiguide-Puro載體上，證明我們已成功構(gòu)建了Lentiguide-Puro-sg載體。通過Westernblot結(jié)果可以看出，經(jīng)過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，CNE 2細胞中S100A8蛋白已不再表達，說明S100A8基因已成功敲除，CNE2-sg構(gòu)建成功。但是本實驗中仍存在一些不足之處，比如CRISPR-Cas9技術(shù)目前僅限于理論研究層面，并未真正用于臨床實際應(yīng)用，且該技術(shù)存在一定的脫靶效率，安全性與穩(wěn)定性仍需進一步分析。

綜上所述，本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了S100A8基因敲除的CNE2細胞系，為S100A8基因?qū)Ρ茄拾┘毎忠u遷移以及增殖凋亡中的作用研究提供了有力工具。