王志君，楊云云，張文靜，王學(xué)彬，宋洪杰，王 卓

(海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433)

伏立康唑(voriconazole)為三唑類廣譜抗真菌藥，2004年被FDA批準為曲霉菌或念珠菌血癥的首選藥物。其抑制麥角甾醇的合成，導(dǎo)致細胞膜的通透性異常，促使真菌細胞死亡，從而發(fā)揮強大的抗真菌效應(yīng)[1]。與其他三唑類抗真菌藥相比，伏立康唑是一種耐受性良好的藥物，但有肝毒性、神經(jīng)毒性，同時伏立康唑的藥動學(xué)個體間差異很大，主要原因是人體內(nèi)的代謝酶CYP2C19具有遺傳多態(tài)性，特別是亞洲人中弱代謝者的發(fā)生率高達15%～20%，同時患者自身的疾病狀態(tài)或合并用藥可能增加伏立康唑代謝的差異[2-7]。因此，對伏立康唑及其主要代謝物伏立康唑氮氧化物進行血藥濃度監(jiān)測具有臨床意義。目前，用于伏立康唑血藥濃度測定的方法主要包括微生物檢測法、高效毛細管電泳(HPCE)法、高效液相色譜-熒光檢測法和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8-11]，考慮到臨床應(yīng)用的實用性和可行性，本研究建立了樣品沉淀蛋白，并用HPLC-UV測定的方法，使其具有快速、靈敏、準確、穩(wěn)定的特點，并可以同時測定伏立康唑及其氮氧化物，以便用于日常治療藥物監(jiān)測(TDM)和個體化給藥調(diào)整。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀(包括SPD-20A紫外檢測器、SIL-20AC自動進樣器、CTO-20A柱溫箱日本島津公司)；C18-AR色譜柱(ACE 150 mm×4.6 mm，柱號：V12-6682)；XW-80A渦旋混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；離心機(Eppendorf AG 22331 Hamburg 5452ZR858343)；SQP電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；pH計(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；DL-180A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；1.5 ml微型離心管(EP管)。

1.2 藥品與試劑

伏立康唑標(biāo)準品(中國藥品食品檢定研究院，批號：100862-201402，含量 99.2%)；罌粟堿(Cayman CHEMICAL 公司，批號：0476735-1，含量≥98%)；伏立康唑氮氧化物(Toronto Research Chemicals公司，批號：7-dpm-64-3，含量97%)；甲醇、乙腈(色譜純)、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉(分析純，上海凌鋒化學(xué)試劑有限公司)；空白人血漿(長海醫(yī)院血庫)。

1.3 數(shù)據(jù)處理軟件

LcSolution版本1.26 SP1(日本島津公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱ACE 5 C18-AR(150 mm×4.6 mm，柱號：V12-6682)，以0.025 mol/L磷酸二氫鈉(含三乙胺400 μl/L，用0.25 mol/L的氫氧化鈉調(diào)至pH為7.0)-乙腈(67∶33)為流動相，檢測波長：255、276 nm(雙波長檢測)，流速：1.0 ml/min，自動進樣器溫度：4 ℃，柱溫：40 ℃，進樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品溶液

2.7.1工作溶液

2.2.2內(nèi)標(biāo)溶液

1.4 方法 患者檢查前均常規(guī)至少禁食12 h及禁水8 h，采用OLYMPUS CLV-290SL電子胃鏡檢查，常規(guī)循鏡至十二指腸降段，檢查時于十二指腸球部或(和)降段發(fā)現(xiàn)蟲體，以活檢鉗鉗出體外后送檢。

2.3 血漿樣品的預(yù)處理

分別取空白血漿、加入內(nèi)標(biāo)溶液的空白血漿、加入伏立康唑和伏立康唑氮氧化物及內(nèi)標(biāo)溶液的空白血漿、使用伏立康唑的患者血漿樣品，按“2.3”項下操作進行前處理，按“2.1”項下方法檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)伏立康唑氮氧化物、罌粟堿、伏立康唑保留時間分別為4.5、11.3、13.7 min，各峰分離度均大于2，理論塔板數(shù)均大于1 000，空白血漿和流動相中干擾組分的響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)的20%，并低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%，結(jié)果見圖1。

2.4 方法專屬性試驗

取血漿0.3 ml于1.5 ml的EP管中，再加乙腈至1.2 ml，渦旋振蕩0.5 min，13 000 r/min離心15 min，取上清液20 μl進樣分析。

2.6.1批內(nèi)回收率和精密度

2.5 線性關(guān)系考察

取空白血漿及伏立康唑和伏立康唑氮氧化物儲備液以及罌粟堿儲備液，將伏立康唑和伏立康唑氮氧化物濃度分別配制為0.5、1、2、5、10、15、20 μg/m1，內(nèi)標(biāo)罌粟堿濃度調(diào)為3.75 μg/m1的混合血漿樣品。按“2.3”項下血漿樣品預(yù)處理，按“2.1”項下色譜條件測定，以伏立康唑氮氧化物和罌粟堿面積的比值(F1)對血漿濃度(C1)進行線性回歸(權(quán)重系數(shù)：1/C)，得回歸方程為：F1=0.111 1 C1+0.020 0，r=0.999 5；以伏立康唑和罌粟堿面積的比值(F2)對血漿濃度(C2)進行線性回歸(權(quán)重系數(shù)：1/C)，得回歸方程為：F2=0.070 74C2-0.038 60，r=0.999 5。結(jié)果表明，伏立康唑和伏立康唑氮氧化物在0.5～20.0 μg/m1濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。定量限濃度為0.2 μg/ml(S/N>10)。

2.6 準確度與精密度試驗

總之，歷史唯物主義內(nèi)在具有公共性維度，這種公共性維度不僅存在于民族國家內(nèi)部，也一定程度上存在于世界范圍內(nèi)。在一定意義上，中國倡導(dǎo)構(gòu)建人類命運共同體就是對歷史唯物主義公共性維度的運用、豐富和發(fā)展。在21世紀，構(gòu)建人類命運共同體，協(xié)調(diào)人的發(fā)展與經(jīng)濟社會發(fā)展，需要重新思考經(jīng)濟社會發(fā)展與人的自由全面發(fā)展的關(guān)系，從主要關(guān)注“我”到更加重視“我們”，培育命運與共的共同體意識和共同體精神，彰顯人類生活的公共性維度。

分別配制定量下限及低、中、高濃度樣品(0.5、1、5、15 μg/m1)的質(zhì)控(QC)血漿樣品，每個濃度取5個樣本，按“2.3”項方法操作，測定。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準曲線測定QC樣品的相對回收率，伏立康唑：101.3%、103.8%、94.2%、91.7%(RSD分別為6.2%、4.4%、4.7%、1.4%，n=5)，伏立康唑氮氧化物：106.8%、100.1%、94.3%、91.6%(RSD分別為6.2%、4.8%、4.7%、2.1%，n=5)。

精密稱取罌粟堿適量置100 ml棕色量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，得濃度為100 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲備液；取內(nèi)標(biāo)儲備液5 ml置100 ml棕色量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得濃度為5 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液，置2～8 ℃冰箱冷藏保存，備用。

雖然大家沒有實際享受到擺渡人帶來的方便，但泡茶館的男人、織毛衣的女人，嘴邊多了一個津津有味的話題，一個謎。在鄉(xiāng)下人簡單的生活里，一切都是日出而作，日落而息，周而復(fù)始，理所當(dāng)然。但擺渡人一下子把他們的生活撕開了一條口子，讓他們看到了這種生活之外的一些氣息，一些他們無法解釋的而又深感興趣的元素。

取血液科服用伏立康唑(同時服用環(huán)孢素A)的臨床患者的血液樣品(采用EDTA抗凝管，取血量2～3 m1)，3 000 r/min離心5 min，取血漿300 μl，加5 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液至1 200 μl，渦旋振蕩0.5 min，13 000 r/min離心15 min，取上清液20 μl進樣分析，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準曲線定量。10例患者中，伏立康唑血藥濃度在0.49～5.2 μg/m1；伏立康唑氮氧化物血藥濃度在0.43～5.5 μg/m1；伏立康唑血藥濃度/伏立康唑氮氧化物血藥濃度的比值在0.63～20之間。在本研究過程中1名患者使用伏立康唑后，臨床醫(yī)生根據(jù)其血液樣品監(jiān)測結(jié)果對患者進行2次給藥方案調(diào)整，最終使伏立康唑血藥谷濃度在有效濃度范圍內(nèi)(1～5 μg/m1)，具體監(jiān)測結(jié)果見表2。在此過程中，通過TDM監(jiān)測，臨床醫(yī)生及時調(diào)整給藥方案，避免低效治療并降低發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險。

分別配制3批的定量下限及低、中、高濃度樣品(0.5、1、5、15 μg/m1)的QC血漿樣品，每個濃度取5個樣本，按“2.3”項方法操作，分3 d進行測定，測定結(jié)果的峰面積代入相應(yīng)的當(dāng)日標(biāo)準曲線，計算QC樣品的回收率，伏立康唑：97.9%、99.6%、102.6%、101.6%(RSD分別為9.2%、5.9%、3.3%、3.6%)，伏立康唑氮氧化物：100.9%、100.0%、97.3%、98.7%(RSD分別為9.3%、6.4%、5.9%、6.7%)。

供應(yīng)鏈管理體系是一種以市場為基準，以客戶需求為中心的管理體系，充分發(fā)揮了市場在經(jīng)濟活動中的推動、限制、優(yōu)勝劣汰等作用，是非常適合當(dāng)前經(jīng)濟市場發(fā)展的管理模式。供應(yīng)鏈管理體系進入中藥材市場，可以有效對既有混亂、力量分散的中藥材市場進行梳理和優(yōu)化，中藥材種植企業(yè)應(yīng)當(dāng)抓住供應(yīng)鏈管理體系的重點，從藥材收購入手進行發(fā)展優(yōu)化。

圖1 伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的專屬性色譜圖 A.空白血漿；B.空白血漿+內(nèi)標(biāo)；C.空白血漿+伏立康唑?qū)φ掌?伏立康唑氮氧化物對照品+內(nèi)標(biāo)；D.患者血漿+內(nèi)標(biāo) 1.伏立康唑氮氧化物；2.伏立康唑；3.罌粟堿

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密稱取伏立康唑標(biāo)準品、伏立康唑氮氧化物標(biāo)準品適量，置50 ml棕色量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，即得400 mg/L的標(biāo)準品儲備液，置2～8 ℃冰箱冷藏保存，備用。

取伏立康唑和伏立康唑氮氧化物乙腈溶液，配成0.5、2.0、15 μg/m1濃度系列，以及罌粟堿乙腈溶液1.0 μg/m1,按“2.1”項下方法處理進樣，分別于日內(nèi)和日間進樣測定，計算日內(nèi)和日間誤差。結(jié)果顯示,伏立康唑日內(nèi)(0、2、4、6、8 h)和日間(3 d)測得濃度的RSD分別為1.6%和1.2%；伏立康唑氮氧化物日內(nèi)(0、2、4、6、8 h)和日間(3 d)測得濃度RSD分別為1.5%和2.0%；罌粟堿測得濃度RSD為1.5%。伏立康唑、罌粟堿和伏立康唑氮氧化物的乙腈溶液3 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.2血漿樣品

“AA+BB”式和AB拓展式有著很大的不同。在“AA+BB”式中，AB并不是一個詞，A和B有可能是單獨成詞，有可能重疊成AA或者BB后才能成詞。如此看來便有以下三種情況：

制備伏立康唑和伏立康唑氮氧化物低、高濃度(含伏立康唑氮氧化物和罌粟堿)的血漿樣品，分別進行：①反復(fù)3次凍融 (-20～25℃)穩(wěn)定性試驗；②含藥血漿樣品(-20℃)放置1個月穩(wěn)定性試驗；③血漿樣品處理后48 h穩(wěn)定性試驗；④血漿樣品自動進樣器中(4℃)放置24 h穩(wěn)定性試驗；⑤樣品常溫放置24 h穩(wěn)定性試驗。按“2.3”項方法操作，每個濃度取5個樣本，測定結(jié)果的峰面積代入相應(yīng)的當(dāng)日標(biāo)準曲線，計算準確度。結(jié)果由表1可見：血漿樣品反復(fù)凍融3次后穩(wěn)定性良好；血漿樣品在-20℃條件下至少可以保存1個月；血漿樣品處理后可在室溫下保存48 h；處理后的血漿樣品在自動進樣器中(4℃)、室溫中至少可保存48 h。

表1 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=5，%)

2.8 臨床標(biāo)本測定應(yīng)用

2.6.2批間回收率和精密度

與管材相關(guān)的影響因素包括管材與接口的影響、管材腐蝕和老化等的影響。管網(wǎng)漏水很多都發(fā)生在接口處，接口處往往是應(yīng)力的集中點，因此容易發(fā)生接口松動、脫落甚至破裂等[2]。造成管材與接口影響的因素有很多，如接口材質(zhì)老化、管道腐蝕、外部工程破壞和地面沉降等。管道在地下受各種酸堿成分、細菌的影響，管材的特性也慢慢發(fā)生變化，如果不及時淘汰很容易造成漏水，同時對城市居民的安全用水也造成威脅。一些外部工程在施工中沒有弄清楚供水管網(wǎng)的布局，在打樁震動、勘探鉆孔中極易造成供水管網(wǎng)的損壞。同時，隨時間的推移，供水管道和路面一起在局部會發(fā)生沉降現(xiàn)象，這種受力不均也極易造成水管破裂、漏水。

表2 患者血藥濃度監(jiān)測結(jié)果(ρB/μg·ml-1)

3 討論

3.1 檢測指標(biāo)成分的選擇

伏立康唑主要在肝臟通過CYP450的同工酶CYP2C19代謝，主要代謝產(chǎn)物為無抗菌活性的伏立康唑氮氧化物，血漿中約占72%。CYP2C19酶呈基因多態(tài)性，其在不同人種、不同基因型患者的伏立康唑代謝具有明顯差異。在給予相同劑量伏立康唑后，因代謝的明顯差異，導(dǎo)致體內(nèi)血藥濃度變化較為明顯，從而引起治療效果不佳或者不良反應(yīng)增加。本研究擬考察伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的濃度來提高治療效果，從而達到精準治療的目的。同時為下一步擬合CYP2C19酶多態(tài)性及伏立康唑、伏立康唑氮氧化物濃度的關(guān)系提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

3.2 流動相的選擇

伏立康唑是三唑類化合物，采用甲醇-乙腈溶劑系統(tǒng)流動相，干擾現(xiàn)象比較嚴重，在流動相中加入適量鹽和三乙胺可抑制其拖尾，改善峰形。本研究曾分別考察了加入不同比例三乙胺、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值對峰形的影響。發(fā)現(xiàn)0.025 mol/L磷酸二氫鈉(三乙胺400 μl/L，用0.25 mol/L氫氧化鈉調(diào)至pH=7.0)-乙腈(67∶33)作為流動相時，峰形對稱，分離效果較好，檢測時間適宜，從而選擇其作為流動相。

人民不再只是坐著，相信別人的胡言亂語?！Z貝爾和平獎得主格鮑伊公開表態(tài)支持“占領(lǐng)華爾街”運動，認為“自己的問題，只有自己解決”

3.3 提取溶媒的選擇

本研究采用以乙腈為沉淀劑的蛋白沉淀法處理血液樣品。采用此方法時，干擾組分的響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)的20%，并低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%，按照《中國藥典》四部通則9012生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則，可作為提取方法。

3.4 檢測波長的選擇

255 nm、276 nm分別為伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的最大吸收波長，在測定部分患者血液樣品時發(fā)現(xiàn)：檢測波長為276 nm時，伏立康唑氮氧化物的干擾小，測定準確性好；檢測波長為255 nm時，伏立康唑的響應(yīng)值高，精密性好，所以選擇雙波長檢測。

3.5 臨床標(biāo)本的測定

由于血液科用藥品種多，用藥方案多變，本研究采用常見的環(huán)孢素A+伏立康唑的患者作為對象，文獻報道[12]：環(huán)孢素A和伏立康唑具有相互作用，伏立康唑影響環(huán)孢素A的血藥濃度，同時兩者均有肝毒性，本研究擬通過監(jiān)測患者(同時使用環(huán)孢素A藥物)伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的血藥濃度，為個體化給藥方案提供數(shù)據(jù)支持，為降低血液科患者這一特殊人群發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險做前期的研究準備工作。