王學雷，晁玉凡，高松燕，董 昕，溫曉飛

(1.上海東方醫(yī)院泌尿外科，上海 200120；2.海軍軍醫(yī)大學藥學院測試中心，上海 200433)

進入21世紀以來，泌尿系結石的患病率在全球范圍內呈現高發(fā)態(tài)勢，并且伴隨全球氣候變暖、人們生活習慣和飲食的變化等，發(fā)病率在繼續(xù)上升[1-2]。最新研究顯示，中國的男性腎結石患病率為6.5%，女性為5.1%[3]。腎結石病程較長且病程反復，在首次發(fā)病后，有50% 的患者可能會在7年內再次發(fā)病[4]。并且腎結石可增加發(fā)生慢性腎病以及終末期腎病的概率[5-6]。

草酸鈣結石約占腎結石的80%[7]，目前對草酸鈣結石的研究認為腎小管上皮細胞的損傷對草酸鈣結石的形成至關重要[8]，而細胞內的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)直接參與損傷的過程[9-10]。由于缺乏對疾病整體動態(tài)的認識，草酸鈣結晶導致腎損傷的機制仍未明確。流行病學研究表明，代謝綜合征患者有較高的結石患病率[11]，且機體代謝紊亂在結石的形成過程中發(fā)揮重要作用[12]，因此對草酸鈣結石進行系統(tǒng)性的代謝評價有利于疾病的發(fā)病機制研究以及早期診斷和個性化防治[1]。代謝組學是繼基因組學、蛋白組學之后系統(tǒng)生物學的重要分支，旨在對反映生物體狀態(tài)變化的內源性代謝物群體進行全面的監(jiān)測和研究[13-14]，可以為草酸鈣結石引起的腎損傷的系統(tǒng)性代謝變化研究提供一個有力工具。

尿液中草酸鹽含量的升高是草酸鈣結石形成的重要因素。目前，乙醛酸鹽作為草酸鹽的前體被用于誘導草酸鈣結石模型[15]。本研究以UPLC-Q-TOF/MS的代謝組學方法為主要研究手段，以常規(guī)組織生化分析為輔助，使用乙醛酸鹽誘導的小鼠草酸鈣結晶模型對草酸鈣結晶造成的腎損傷過程中尿液內源性代謝物的變化情況進行系統(tǒng)研究，為疾病的形成機制研究以及早期生物標志物的篩選提供方向。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

色譜級甲醇、乙腈(Merck,Germany)。HPLC級甲酸(Fluka,Switzerland)。乙醛酸(TCI,Japan)，加入NaOH調至pH7.4配成乙醛酸鹽。超純水由Milli-Q水凈化系統(tǒng) (Millipore Corp.,USA)制備得到。色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、?；撬?、尿酸標準品(Sigma-Aldrich,USA)。

1.2 乙醛酸鹽誘導的小鼠結晶腎損傷模型的建立[16]

18只7～8周齡C57B/L6雄性小鼠購自上海斯萊克斯實驗動物有限公司。經過1周的適應性飼養(yǎng)，將小鼠隨機分為3組，對照組(U0)、模型1 d組(U1)和模型5 d組(U5)，每組6只。模型組每天腹腔注射100 mg/kg的乙醛酸鹽造模，對照組每天腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 生物樣本的采集[16]

對照組和模型組在最后一次注射后，置于代謝籠中收集24 h尿液(正常飲水，禁食)，4 000 r/min離心5 min后，取上清液。眼眶取血，室溫靜置1 h后，3 500 r/min，4℃離心15 min，取血清。所有離心后尿樣和血清于-80 ℃凍存。行心臟灌流后，采集腎臟，置于4%多聚甲醛中固定。

1.4 動物模型評價

測定各組血清中肌酐和尿素氮含量。將固定后的腎組織用石蠟包埋，切成3～4 μm的薄片，采用馮庫薩試劑盒(杰美基因，上海)進行染色。在400倍放大倍數下，觀察腎組織鈣沉積情況。

1.5 樣品的制備

將尿液在4 ℃解凍后，取100 μl尿樣，加入300 μl甲醇進行蛋白沉淀和代謝物提取。渦旋5 min，將樣品置于4 ℃靜置10 min，于13 000 r/min、4 ℃離心10 min。取150 μl上清液于進樣小瓶中待分析。此外，每個樣本各取50 μl上清液混合成質控樣本(quality control,QC)，用于考察系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1.6 尿樣的UPLC-Q-TOF /MS分析

UPLC-Q-TOF/MS分析使用安捷倫1290 Infinity 液相系統(tǒng)和安捷倫6538 高分辨單四級桿-飛行時間串聯(lián)質譜聯(lián)用儀 (Agilent,USA) 。色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm,Waters)，柱溫40 ℃。流動相為0.1%甲酸(A)-含0.1%甲酸的乙腈(B)。優(yōu)化后的梯度條件：0～2 min,5% B; 2～10 min,5%～15% B; 10～14 min,15%～30% B; 14～17 min,30%～95% B; 17～19 min,95% B。流速：0.4 ml/min，進樣量：3 μl，自動進樣器溫度：4 ℃。

質譜使用電噴霧離子源(ESI)采集正、負離子數據。為了監(jiān)測及考察系統(tǒng)的穩(wěn)定性，在尿液的正、負離子模式下分別隨機插入6針QC。通過無監(jiān)督的主成分分析(PCA)中QC的聚集程度考察系統(tǒng)的穩(wěn)定性。同時，計算每個離子在QC樣品中的相對標準偏差(RSD，%)，如RSD大于20%認為變異較大，其顯著性的差異可能是由于偶然相關造成的[17]。

1.7 數據處理及統(tǒng)計學分析

使用R軟件平臺，調用XCMS程序包，進行峰的識別、校正和積分。將變量根據80%原則篩選去除噪音信號[18]和面積歸一化后，導入到SIMCA-P 11.0 (Umetrics,Sweden)進行多元統(tǒng)計分析。采用無監(jiān)督的PCA分析表征樣本組間的分離趨勢以及觀測離群值[19]，用得分圖表征結果。采用有監(jiān)督的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)進行差異物質的篩選，用得分圖和S-Plot圖表征結果。S-Plot圖中每個點代表一個變量，離原點越遠的變量，其可能對組間差異的貢獻率越大，則VIP(variance importance)值就越大[20]。并根據R2、Q2值以及排列測試的結果對模型進行驗證[21]，R2表示數據模型在某方向上可以解釋的變量與總變量的比值，Q2表示模型的預測能力[22]。將VIP值大于1的變量作為顯著差異物質的候選變量。

1.8 差異代謝物的鑒別[23]

首先，利用在線網絡數據庫如Metlin(http://metlin.scripps.edu/),Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca/)進行匹配，以及利用MassHunter定性軟件對精確m/z值進行分子式匹配，對離子進行推斷性鑒別；然后，進行MS/MS分析，對采集的MS/MS碎片與Metlin數據庫中的碎片信息進行比對以確定代謝物；對于易得到標準品的代謝物，將其保留時間以及MS/MS碎片信息與標準品進行比對，最終確證代謝物。

2 結果與討論

2.1 腎鈣含量測定

馮庫薩染色(圖1)顯示，對照組的腎臟中未出現鈣沉積，模型組的腎小管腔及間質中均可見大量的黑色鈣鹽沉積，腎小管腔明顯擴大。且U5組的鈣鹽沉積情況比U1組更明顯。

2.2 血清生化指標分析

如圖2所示，與U0組相比，U5組中血肌酐(P<0.05)、尿素氮(P<0.001)的含量均顯著升高，且U5組尿素氮的含量比U1組明顯上升(P<0.05)，表明模型組出現了一定的腎損傷。

圖1腎臟組織的馮庫薩染色圖(×400) A.U0組；B.U1組；C.U5組

圖2 血清中的肌酐和尿素氮含量 A.肌酐含量；B.尿素氮含量*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與U0組比較；#P<0.05，與 U1組比較

2.3 尿液代謝組學輪廓分析與差異代謝物的篩選

UPLC-Q-TOF/MS采用正、負兩種模式對尿液進行數據采集，兩種模式下典型的總離子流圖(TIC)見圖3，色譜峰分布均勻。如圖4所示，正、負離子模式下，QC的聚集狀況均良好，表明系統(tǒng)的穩(wěn)定性良好。U0組、U1組和U5組的PCA得分如圖5 A、5B所示，U5與U0組分離趨勢顯著，U1與U0組分離趨勢不明顯。同時，筆者使用Metaboanalyst軟件將3組數據進行聚類分析，從圖 5 C、5D可以看出，U1組的個體差異較大，不能與U0很好的區(qū)分。因此，對U5與U0組尿液進行有監(jiān)督的PLS-DA分析，篩選乙醛酸鹽誘導的結晶腎損傷的差異代謝物。根據R2、Q2值以及排列測試對PLS-DA模型進行驗證。PLS-DA得分和S-Plot見圖6 A-D所示，正、負離子模式下U0和U5組明顯分離。正模式下，R2Y=0.98，Q2=0.708；負模式下，R2Y=0.992，Q2=0.786；排列測試圖如圖6 E、6F所示，模型均良好，未出現擬合現象。筆者結合VIP值和離子在組間的變化倍數(fold change,FC)篩選差異物質。VIP >1且|FC|>1.5的離子認為是U0和U5組的顯著差異離子，同時剔除在QC樣本中RSD (%) 值大于20的離子。經獨立樣本t檢驗，認為P<0.05的變量是乙醛酸鹽誘導的結晶腎損傷尿液中潛在的生物標志物。

圖3 尿液正、負離子模式下典型的總離子流圖 A.正離子模式下；B.負離子模式下

圖4 3組尿樣及QC樣品正、負離子模式下的主成分分析得分圖 1.正離子模式下；B.負離子模式下

對差異代謝物進行鑒別，最終從尿液中鑒別出21個差異代謝物，見表1。

表1 乙醛酸鹽誘導的結晶腎損傷小鼠尿液差異代謝物列表

(續(xù)表1)

注：“—”表示缺失碎片離子

圖5 尿液正、負離子模式下的U0組、U1組和U5組的聚類分析 A.正離子模式下3組PCA得分圖；B.負離子模式下3組PCA得分圖；C.正離子模式下3組聚類樹狀圖；D.負離子模式下3組聚類樹狀圖

如表1所示，與對照組(U0)相比，模型組(U1、U5)尿液中代謝物有11種顯著下調，10種顯著上調。其中，三甲基賴氨酸、尿酸、蘇氨酸、苯乳酸、?；撬帷?-吡哆酸顯著下調；琥珀酸、賴氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、氧代壬酸和脂肪?；拾彼犸@著上調。為了直觀地展現差異物質在3組中的變化趨勢，筆者使用Metaboanalyst軟件(http://www.metaboanalyst.ca)繪制熱圖(圖7)。

3 討論

對篩選出的21種差異代謝物建立代謝相關網絡 (圖8)，涉及的通路有氨基酸代謝、能量代謝、?；撬岽x、次?；撬岽x、 VB代謝和嘌呤代謝等。

模型組尿液中芳香族氨基酸(AAA)苯丙氨酸和色氨酸明顯升高，表明在結晶腎損傷過程中AAA代謝受到干擾，這與腎臟疾病跟AAA降解、合成或排泄密切相關[24-25]。?；撬崾遣溉閯游锛毎幸环N重要的含硫β-氨基酸[26]，被認為是一種內源性抗氧化劑和膜穩(wěn)定劑。許多研究已經證明牛磺酸對多種類型腎損傷的保護作用，包括缺血/再灌注損傷、高血糖、氧化應激和外源性物質造成的損傷[27]。而模型組中?；撬犸@著下降，表明?；撬岷痛闻；撬岽x在結晶損傷過程中受到干擾。

脂肪酰甘氨酸作為脂肪酸的代謝產物，由乙酰輔酶A(acyl-CoA)與甘氨酸在線粒體酶甘氨酸N-?；D移酶(glycine N-acyltransferase)的催化作用下產生[28]。而在一些有機酸血癥中，由于甘氨酸N-?；D移酶的高親和力，一些acyl-CoA與甘氨酸的結合優(yōu)于與卡尼汀的結合[29]，從而影響線粒體內脂肪酸的β氧化[30-32]。本研究中，模型組尿液中的乙烯乙酰甘氨酸顯著上升，表明乙醛酸鹽誘導的結晶腎損傷過程中脂肪酸β氧化可能出現障礙，而脂肪酸β氧化異常會導致脂質過氧化和氧自由基的產生，這也與ROS的累積與腎小管細胞的損傷以及鈣鹽的附著有重要關系結論[33-35]相一致。

4-吡哆酸是VB6的重要代謝產物，VB6轉化成4-吡哆酸后排出體外。VB6可以通過減少草酸的內源性合成抑制草酸鈣結晶的形成，多項研究表明補充VB6可以減少尿液中草酸的排泄[36-39]。內源性草酸可以經甘氨酸-乙醛酸-草酸[40]途徑合成。VB6是氨基酸代謝中轉氨酶的輔酶[38]，大量VB6存在時，乙醛酸可以在丙氨酸乙醛酸氨基轉移酶(alanine glyoxylate aminotransferase，AGT)催化下氨基化，轉化成甘氨酸，減少草酸的生成，而乙醛酸的上游代謝物乙醇酸也會轉化為VB6。本研究中，小鼠給予乙醛酸后，4-吡哆酸的含量在尿液中顯著下降，表明存在大量乙醛酸時干擾VB6的代謝。

尿酸是嘌呤代謝中的重要物質，在機體內，次黃嘌呤可以被代謝為黃嘌呤，而黃嘌呤可以被繼續(xù)代謝為尿酸。本研究中，模型組尿樣中尿酸的含量下降表示尿酸經腎臟的排泄發(fā)生障礙。作為嘌呤代謝的重要下游產物，尿酸對腎臟疾病的影響存在很大爭議。有報道稱尿酸對慢性腎臟病(CDK)的進展是一個潛在的重要風險因素，也有一些研究表明，可溶性尿酸作為一種強大的抗氧化劑，可以發(fā)揮其保護作用[41-43]。雖然尿酸的作用在本文中無法很好的闡述，但可以說明在此模型結晶形成過程中嘌呤代謝受到了強烈干擾，給繼續(xù)研究其機制以及標志物的篩選提供了重要參考。

本研究中，課題組利用乙醛酸鹽誘導的小鼠結晶腎損傷模型，采用基于UPLC-Q-TOF/MS的代謝組學方法從尿液中篩選出21個差異代謝物，主要涉及氨基酸代謝、能量代謝、?；撬岷痛闻；撬岽x、嘌呤代謝和VB6代謝，為疾病機制研究以及早期標志物的篩選提供了重要參考，但要闡明疾病的具體機制可能還需要結合蛋白質組學數據。