伍先明 李愛瓊 周麗麗 李 堅(jiān) 陽 帆④

(郴州市第一人民醫(yī)院老年病科，郴州423000)

持續(xù)高糖是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)病的主要因素。大量證據(jù)表明，高血糖主要是通過活性氧(ROS)過量生產(chǎn)、增加氧化應(yīng)激和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)的發(fā)展而導(dǎo)致組織損傷[1]。對于糖尿病患者而言，即便血糖控制得到改善，ROS介導(dǎo)的血管應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)存在依然會引起持續(xù)性的血管損傷[2,3]。胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide 1，GLP-1)是腸道L 細(xì)胞分泌的一種激素，生理情況下GLP-1的半衰期非常短，能迅速被二肽基肽酶-4(Dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)降解。GLP-1主要參與穩(wěn)定血糖的作用，并能改善糖尿病的內(nèi)皮功能。臨床上對于T2DM患者的治療策略主要是通過抑制DPP-4活性或使用GLP-1類似物來增加腸促胰島素反應(yīng)[4]。除此之外，某些DPP-4也顯示出抗氧化能力，如替格列汀可改善內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)和凋亡，并能克服長期暴露于高糖誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞的代謝記憶效應(yīng)[5]。曲格列汀(Trelagliptin)是由日本武田公司最近開發(fā)的一種DPP-4抑制劑，由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，在機(jī)體內(nèi)的代謝非常緩慢， 1周僅需給藥1 次[6,7]。然而迄今其為止尚無曲格列汀其他方面的研究。本研究旨在探討曲格列汀對高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞和抗氧化反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 曲格列汀購自日本武田制藥。Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)為同仁化學(xué)研究所(Dojindo)提供。RNA提取試劑盒為Qiagen產(chǎn)品。鼠抗人Bip1/Grp78、PDI、Ero1-Lα、Calnexin、IRE-1α、p-eIF2α及Nrf2抗體購自Santa Cruz。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)由中國科學(xué)院干細(xì)胞庫提供，并用含10%熱滅活的胎牛血清，50 U/ml青霉素和50 g/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長到視野80%～90%密度時(shí)，棄培養(yǎng)基，加入5 ml無菌PBS漂洗3次，經(jīng)胰酶消化后，加入新鮮培養(yǎng)基并按照比例進(jìn)行傳代。本研究用的細(xì)胞傳代次數(shù)在25～30次。實(shí)驗(yàn)分為對照組、高糖組及曲格列汀干預(yù)組。其中對照組葡萄糖濃度為5.0 mmol/L，高糖組細(xì)胞含葡萄糖25 mmol/L。曲格列汀干預(yù)組在高糖組的基礎(chǔ)上分別加入1、5、10 μmol/L曲格列汀作用24 h。

1.2.2細(xì)胞活性測定 采用CCK-8實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞活性。接種于96孔板中的HUVECs(細(xì)胞數(shù)約4×103)經(jīng)曲格列汀處理結(jié)束后，每孔加入CCK-8溶液100 μl(CCK-8濃度為10%)，37℃孵育2 h。酶標(biāo)儀下測定450 nm波長的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞的相對活性，計(jì)算公式為：細(xì)胞相對活性=處理組OD值/對照組OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3RT-qPCR檢測mRNA的表達(dá) 采用Qiagen公司提供的RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。隨后將其逆轉(zhuǎn)錄為DNA后，采用實(shí)時(shí)定量PCR分析NOX4和p22phoxmRNA的表達(dá)。本文所用的引物如下：NOX4 forward 5′-CTTCCGTTGGTTTGCAGATT-3′，reverse 5′-TGGGTCCACAACAGAAAACA-3′。p22phox：forward 5′-GTACTTTGGTGCCTACTCCA-3′；reverse 5′-CGGCCCGAACATAGTAATTC-3′。GAPDH：forward 5′-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，reverse 5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′。反應(yīng)于ABI Prism 7900上進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果用2-ΔΔCt表示。

1.2.4Western blot分析蛋白表達(dá)與磷酸化 曲格列汀處理結(jié)束后，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min；12 000 r/min 4℃離心20 min，上清即為總蛋白。使用Pierce提供的試劑盒提取細(xì)胞核總蛋白(Pierce,Rockford,IL)。隨后獲取各處理組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。經(jīng)封閉和洗膜后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，分別用Bip1/Grp78、PDI、Ero1-Lα、Calnexin、IRE-1α、p-eIF2α及Nrf2抗體(Santa Cruz)孵育。隨后再用HRP標(biāo)記二抗孵育，最后經(jīng)化學(xué)發(fā)光、顯影，并用Image J(National Institute of Health,Bethesda,MD,USA)軟件進(jìn)行灰度掃描。

2 結(jié)果

2.1不用濃度曲格列汀對HUVECs活性的影響 采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度曲格列汀對HUVECs活性的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，1、5和10 μmol/L 曲格列汀作用24 h并不能降低細(xì)胞的活性，相反能輕微上調(diào)其水平，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此在隨后的研究中我們選用該濃度范圍的曲格列汀作為研究濃度，見圖1。

2.2曲格列汀對細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響 采用熒光染料H2DCFDA測定細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的變化。結(jié)果顯示，與5%葡萄糖濃度組相比，高糖條件下細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著增高。而經(jīng)不同濃度曲格列汀處理后，胞內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著降低，表明曲格列汀可有效降低高糖調(diào)劑下細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，見圖2。

圖1 不同濃度曲格列汀對HUVECs活性的影響Fig.1 Effects of different concentration of Trelagliptin on activity of vascular endothelial cells

圖2 不同濃度曲格列汀對HUVECs活性氧產(chǎn)生的影響(×400)Fig.2 Effects of different concentrations of Trelagliptin on production of reactive oxygen species in HUVECs(×400)

圖3 不同濃度曲格列汀對NAD(P)H氧化酶表達(dá)的影響Fig.3 Effect of different concentrations of Trelagliptin on expression of NAD(P)H oxidaseNote: Compared with the normal glucose group,*.P<0.05;compared with the high glucose group,#.P<0.05.

圖4 曲格列汀上調(diào)細(xì)胞核中Nrf2表達(dá)Fig.4 Upregulation of Nrf2 expression in nucleus by Trelagliptin

2.3曲格列汀對NAD(P)H氧化酶表達(dá)的影響 ROS的產(chǎn)生主要受NAD(P)H氧化酶的調(diào)控，為了觀察高糖對ROS的影響是否與NAD(P)H有關(guān)，我們隨后檢測了其表達(dá)水平。如圖3所示，高糖條件下，NAD(P)H氧化酶的NOX4亞基和p22phox亞基mRNA表達(dá)水平明顯增高。但給予曲格列汀處理后，p22phox亞基mRNA水平明顯減少。

2.4曲格列汀激活Nrf2 NAD(P)H氧化酶誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生后，可直接激活核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2，后者隨后可誘導(dǎo)多種抗氧化應(yīng)激蛋白的表達(dá)。為了觀察曲格列汀是否能激活Nrf2，我們采用Western blot檢測了Nrf2的核轉(zhuǎn)位。結(jié)果顯示，高糖條件下可輕微上調(diào)細(xì)胞核蛋白中Nrf2的表達(dá)水平，而曲格列汀處理后，Nrf2表達(dá)進(jìn)一步增多，見圖4。

圖5 曲格列汀誘導(dǎo)HO-1和NQO1表達(dá)Fig.5 Trelagliptin inducing HO-1 and NQO1 expression

圖6 曲格列汀對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)的影響Fig.6 Effect of Trelagliptin on expression of stress-related molecules in endoplasmic reticulum

2.5曲格列汀誘導(dǎo)HO-1和NQO1表達(dá) Nrf2可廣泛調(diào)控一系列細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，如HMOX、NQO1。Western blot結(jié)果顯示，曲格列汀處理后，可進(jìn)一步上調(diào)HMOX和NQO1水平，見圖5。

2.6曲格列汀改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在糖尿病中發(fā)揮重要作用。因此我們隨后也檢測了曲格列汀對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的影響。圖6顯示，高糖條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子Bip1/Grp78、PDI、Ero1-Lα、Calnexin、IRE-1α和p-eIF2α表達(dá)水平明顯增高，給予曲格列汀處理后，這些分子表達(dá)水平明顯減少。相比之下，曲格列汀對正常血糖組培養(yǎng)的細(xì)胞無明顯影響。

3 討論

GLP-1受體在體內(nèi)多種組織器官中均有表達(dá)，它不但可促進(jìn)胰島素分泌改善血糖代謝，還可能具有胰島素外的作用。DPP-4抑制劑是治療T2DM的有效藥物，不但能延長GLP-1的半衰期，同時(shí)還具有心血管系統(tǒng)保護(hù)作用，且該效應(yīng)獨(dú)立于GLP-1途經(jīng)之外[4]，如西格列汀能在一定程度上減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積并下調(diào)細(xì)胞因子表達(dá)，并對糖尿病腎損傷具有保護(hù)作用[8]。可能與以下機(jī)制有關(guān)：①改善糖化血紅蛋白含量；②與腎小管刷狀緣DPP-4底物相互作用而改善腎臟功能；③激活cAMP，抑制NF-κB激活，抑制內(nèi)皮細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子與炎癥介質(zhì)[9]；④抑制腎組織8-羥基脫氧鳥苷的表達(dá)，上調(diào)SOD表達(dá)。曲格列汀作為一種新型的DPP-4抑制劑，其降糖之外的活性目前尚不清楚。在本研究中，我們得到了以下重要發(fā)現(xiàn)：①曲格列汀具有抗氧化特征，能減輕高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，并能誘導(dǎo)抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)。②高糖條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損，而曲格列汀能有效改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激功能。研究發(fā)現(xiàn)西格列汀以及阿格列汀能對抗ROS的產(chǎn)生，本研究主要報(bào)道曲格列汀在所設(shè)定的濃度范圍內(nèi)直接影響內(nèi)皮細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。隨后我們也研究了曲格列汀對細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激的相關(guān)分子的表達(dá)。結(jié)果顯示，曲格列汀可顯著上調(diào)Nrf2的表達(dá)，其所調(diào)控的抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因如HMOX和NQO也明顯增高。

近年來，高血糖導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失調(diào)已經(jīng)日益受到重視。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是一種動(dòng)態(tài)管狀網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，參與細(xì)胞多種生物學(xué)功能，尤其是蛋白質(zhì)的正確折疊[10]。ER功能障礙是β細(xì)胞喪失功能的重要機(jī)制，也是糖尿病患者脂肪組織、肝臟以及心血管系統(tǒng)組織損傷的重要機(jī)制[11,12]。本研究也證實(shí)高糖條件下ER相關(guān)分子Bip1/Grp78、PDI、Ero1-Lα、Calnexin、IRE-1α和p-eIF2α表達(dá)水平明顯增高，而給予曲格列汀處理后，這些分子水平明顯降低，這表明曲格列汀能明顯改善高糖條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

總之，本研究證實(shí)曲格列汀能增加高糖條件下Nrf2相關(guān)基因的表達(dá)，從而改善氧化應(yīng)激水平并減少ROS的產(chǎn)生。其次，曲格列汀也能減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而促進(jìn)細(xì)胞功能恢復(fù)。盡管臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞廣泛用于脈管系統(tǒng)的相關(guān)研究，但它與成年T2DM中血管內(nèi)皮細(xì)胞功能有所不同，因此在未來研究中將進(jìn)一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以進(jìn)一步探討。