江義霞 李匡政 席云祝 劉 青 賈遠(yuǎn)航

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，衡陽(yáng)421001)

非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是當(dāng)前全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，明確其發(fā)病機(jī)制是對(duì)該病進(jìn)行治療的關(guān)鍵[1，2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要和起始環(huán)節(jié)[3]。Ephrin B2作為酪氨酸激酶受體/配體家族中的一員，其能夠通過(guò)細(xì)胞間的相互排斥作用，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞和血管的形成和發(fā)育起調(diào)控作用[4]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2在多種腫瘤中均存在異常表達(dá)現(xiàn)象，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移呈明顯正相關(guān)[5]。但Ephrin B2表達(dá)與NSCLC發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在通過(guò)檢測(cè)肺癌和癌旁正常肺組織中Ephrin B2以及標(biāo)記蛋白和與促腫瘤轉(zhuǎn)移因子的表達(dá)，探討Ephrin B2與NSCLC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象 收集我院病理科10年間肺癌手術(shù)切除蠟塊標(biāo)本98例，同時(shí)取癌旁正常肺組織蠟塊34例作為對(duì)照。98例NSCLC患者中，男67例，女31例，年齡41～75歲，鱗癌59例，腺癌33例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者58例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例，依據(jù)2009年國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)(International Association for the Study of Lung Cancer,IASLC)第七版分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ+Ⅱ期53例，Ⅲ期45例。本研究所有入組標(biāo)本臨床資料及隨訪完整，并經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批同意。

1.1.2主要試劑 山羊血清封閉液購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，鼠抗人Ephrin B2單克隆抗體、生物素標(biāo)記的兔抗鼠IgG工作液由北京義翹神州科技有限公司 提供，Western blot中抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，人肺腺癌A549細(xì)胞由美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)提供。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué) 取甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋后切片并置于60℃溫箱烘1 h，使用二甲苯、梯度酒精、蒸餾水對(duì)切片進(jìn)行處理。高原抗壓修復(fù)后PBS沖洗，加入10%正常山羊血清封閉液、鼠抗人Ephrin B2單克隆抗體、生物素標(biāo)記的兔抗鼠IgG二抗工作液、鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶溶液。PBS沖洗、DAB顯色、1%氨水返藍(lán)后使用梯度酒精脫水。各切片選擇5個(gè)高倍鏡視野，依據(jù)著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比值判定免疫組化結(jié)果。結(jié)果判讀由專業(yè)病理科醫(yī)師采用雙盲法判定(重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 將人A549細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后選取第3代細(xì)胞分為4組：空白組(Blank組)，不轉(zhuǎn)染任何序列；陰性對(duì)照(NC組)；Ephrin B2 vector組，用脂質(zhì)粒體方法轉(zhuǎn)染Ephrin B2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；sh-Ephrin B2組，用脂質(zhì)粒體方法轉(zhuǎn)染含有Ephrin B2干擾片段的質(zhì)粒，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞置于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)然后使用250 μl 不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM對(duì)各組細(xì)胞稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 提取轉(zhuǎn)染后各組A5490 NSCLC細(xì)胞中總RNA。使用Premier 5.0軟件進(jìn)行qRT-PCR引物設(shè)計(jì)，并由Invitrogen設(shè)計(jì)合成Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin，Vimentin以及MMP-2引物，GAPDH做內(nèi)參照，引物序列見(jiàn)表1。使用PrimeScript RT試劑盒(RR036A，TaKaRa)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系10 μl，參照說(shuō)明書進(jìn)行以2 μg總RNA為模板，用GAPDH作為內(nèi)參引物采用相對(duì)定量法(2-ΔΔCt法)計(jì)算目的基因Ephrin B2、E-cadherin(上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白)、N-cadherin，Vimentin(間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白)、MMP-2 mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平：ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 提取各組細(xì)胞總蛋白并測(cè)定蛋白濃度，將分離蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，5% BSA室溫下封閉1 h。滴加一抗兔多抗Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2后于4℃過(guò)夜。PBS沖洗后孵育HRP 標(biāo)記的兔抗人IgG抗體。室溫下膜與ECL液反應(yīng)1 min。吸去液體，覆蓋保鮮膜，拍攝X光片。以GAPDH作內(nèi)參，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶的灰度值之比作為蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染48 h后收集各組A549 NSCLC細(xì)胞，以1×105/孔的密度接種于6孔板，借助無(wú)菌200 μl Tip頭在同等力度下在每個(gè)孔底部橫豎各劃4條痕，棄去原培養(yǎng)液，每孔加入無(wú)血清培養(yǎng)液2 ml并且將其置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在劃痕后的第0、24小時(shí)后于倒置顯微鏡下拍照，各樣本均取5個(gè)視野細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均值，對(duì)劃痕點(diǎn)寬度進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算各組劃痕愈合率，劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%，測(cè)量連續(xù)進(jìn)行3次，依據(jù)結(jié)果評(píng)價(jià)各組細(xì)胞遷移能力。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequences

Target geneUpstream primer(5′-3′)Downstream primers(5′-3′)Ephrin B2ATGACAAGCTCTACCAGAGAGACCACATTAGTGGTGACTGTTGGAAE-cadherinCGAGAGCTACACGTTCACGGGGGTGTCGAGGGAAAAATAGGN-cadherinTTTGATGGAGGTCTCCTAACACCACGTTTAACACGTTGGAAATGTGVimentinGCCCTAGACGAACTGGGTCGGCTGCAACTGCCTAATGAGMMP-2AGATCTTCTTCTTCAAGGACCGGTTGGCTGGTCAGTGGCTTGGGGTAGAPDHAATGGGCAGCCGTTAGGAAAGCGCCCAATACGACCAAATC

Note：MMP-2.Mitochondrial membrane potentia；GAPDH.Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

2 結(jié)果

2.1NSCLC組織和癌旁正常組織中Ephrin B2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率 免疫組化檢測(cè)NSCLC患者的組織石蠟標(biāo)本以及癌旁組織中的Ephrin B2蛋白表達(dá)情況顯示(圖1)，Ephrin B2在NSCLC組織和癌旁組織中均存在表達(dá)，胞核內(nèi)見(jiàn)到黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。肺癌組織和癌旁組織中呈現(xiàn)Ephrin B2蛋白高表達(dá)的共55例和7例，肺癌組織Ephrin B2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)。對(duì)Ephrin B2蛋白表達(dá)情況與患者臨床參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2表達(dá)與患者性別、年齡、分期、病理類型及分級(jí)等參數(shù)沒(méi)有直接關(guān)系(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.2qRT-PCR檢測(cè)A549細(xì)胞Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)A549細(xì)胞Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達(dá)結(jié)果顯示(圖2)： Blank組與NC組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Blank組相比，Ephrin B2 vector組Ephrin B2、 N-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達(dá)上升(P<0.05)，E-cadherin mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)。sh-Ephrin B2組Ephrin B2、 N-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)，E-cadherin mRNA表達(dá)水平上升(P<0.05)。

2.3Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達(dá) Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達(dá)結(jié)果顯示(圖3)： Blank組與NC組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Blank組相比，Ephrin B2 vector組Ephrin B2、 N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達(dá)上升(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)。sh-Ephrin B2組Ephrin B2、 N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05)。

圖1 Ephrin B2蛋白在NSCLC和正常組織中的表達(dá)(×200)Fig.1 Expression of Ephrin B2 protein in NSCLC tissues and normal tissues(×200)Note: Normal.Expression of Ephrin B2 protein in normal lung tissue(IHC score：1)；Tumor-L.Expression of Ephrin B2 protein in NSCLC tissues that was stained weakly positive(IHC score：2)；Tumor-H.Expression of Ephrin B2 protein in NSCLC tissues that was stained strongly positive(IHC score：16).

表2 Ephrin B2表達(dá)與NSCLC臨床特征的關(guān)系

Tab.2 Relationship between expression of Ephrin B2 and clinical features of NSCLC

FeaturesEphrin B2Low expressiongroupHigh expressiongroupχ2PSmokingNon smoker9110.0000.992Smoker3543Chronic cardiopulmonary diseaseYes24260.3970.529No2028Clinical stagesⅠ-Ⅱ26270.4580.499Ⅲ1926Metastasis(pN)Yes28300.6550.418No1624Pathological typeSquamous cell carcinoma28310.4420.802Adenocarcinoma1518Others24Organization classificationModerate and highdifferentiation28422.3760.123Poor differentiation1612

圖2 A549細(xì)胞中Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA表達(dá)的差異Fig.2 mRNA expression of Ephrin B2,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin in A549 cell linesNote: Compared with blank group，*.P<0.05.

圖3 A549細(xì)胞中Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)差異Fig.3 Protein expression of Ephrin B2,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin in A549 cell linesNote: A.Protein expression profile;B.Protein expression of Ephrin B2,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin in A549 cell lines.Compared with blank group，*.P<0.05.

圖4 各組細(xì)胞的遷移能力差異Fig.4 Differences of migration and invasionability in A549 cell linesNote: A.Cell scratch test′s result of A549 cell lines;B.Bar graphof cell migration experiment result in A549 and H520 cell lines.Compared with blank group,*.P<0.05.

2.4Ephrin B2與A549細(xì)胞的遷移作用關(guān)系 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4)：Blank組與NC組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Blank組比較，Ephrin B2 vector組NSCLC細(xì)胞遷移上升(P<0.05)；sh-Ephrin B2組NSCLC細(xì)胞遷移下降(P<0.05)。

3 討論

Eph(Erythropoietin producing hepatocellular carcinoma cell line)是當(dāng)前已知的最大的受體型酪氨酸激酶家族，其在人體的病理和生理過(guò)程中均扮演著重要角色[6]。Ephrin(Eph family receptor interacting proteins)為Eph的配體，受體能夠和配體通過(guò)相互接觸而結(jié)合，被對(duì)方激活進(jìn)而實(shí)現(xiàn)磷酸化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。Ephrin B2作為一種跨膜蛋白，近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于鼻咽癌、肝癌以及乳腺癌等惡性腫瘤中[8-10]。

本研究利用免疫組化方法對(duì)NSCLC患者肺癌組織以及癌旁正常肺組織中Ephrin B2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2蛋白在肺癌組織中的表達(dá)(56.12%)顯著高于其在癌旁正常肺組織中的表達(dá)(20.59%)，且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。分析Ephrin B2蛋白表達(dá)與患者臨床參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)，二者之間不存在直接關(guān)系(P>0.05)。有研究在探討Ephrin B2蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)Ephrin B2與腫瘤基因R-Ras存在關(guān)聯(lián)，Ephrin B2受體能夠激活Ras-MARK以及ATK信號(hào)途徑。該系統(tǒng)能夠?qū)?xì)胞分裂素活化蛋白激酶通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生成，增強(qiáng)其侵襲性[11]。另外，關(guān)于Ephrin B2表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌關(guān)系的研究顯示，Ephrin B2以及EphB4二者在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)均顯著升高，且二者存在相關(guān)性[12]。提示EphB4可能通過(guò)與Ephrin B2相結(jié)合并且激活Ephrin B2來(lái)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌新生血管生成、促進(jìn)其發(fā)生和轉(zhuǎn)移的目的。本研究觀察NSCLC組織中Ephrin B2的表達(dá)以及NSCLC組織上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移情況，肺癌組織中間質(zhì)標(biāo)記蛋白以及促腫瘤轉(zhuǎn)移因子的蛋白和mRNA表達(dá)相對(duì)于癌旁組織顯著升高(P<0.05)。提示NSCLC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)。qRT-PCR篩選出肺腺癌和肺鱗癌A549和H520細(xì)胞系后，檢測(cè)Ephrin B2基因和NSCLC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志性因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Blank組與NC組相比，Ephrin B2 vector組Ephrin B2、 N-cadherin、Vimentin和Fibronectin mRNA以及蛋白的表達(dá)均顯著上升(P<0.05)，而上皮標(biāo)記蛋白的mRNA以及蛋白表達(dá)均顯著下降。進(jìn)一步說(shuō)明了Ephrin B2基因在促進(jìn)NSCLC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用。另外，Ephrin B2 vector組中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)顯著增強(qiáng)，提示Ephrin B2基因能夠促進(jìn)NSCLC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)移。劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，Ephrin B2上調(diào)在促進(jìn)A549和H520 NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲中其重要作用。Kore等[13]在探究Ephrin B2表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2表達(dá)與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。Ephrin B2表達(dá)對(duì)腫瘤的侵襲、惡性程度的增強(qiáng)起推動(dòng)作用[14]。與本研究中結(jié)果一致。我們使用Hoechst33342/PI核熒光雙染對(duì)兩組細(xì)胞系細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2上調(diào)能夠促進(jìn)A549和H520 NSCLC細(xì)胞的凋亡，這可能與隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞缺乏營(yíng)養(yǎng)存在一定關(guān)聯(lián)。而使用CCK-8法以及細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)兩組細(xì)胞系的增殖和克隆情況進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2上調(diào)能夠促進(jìn)A549和H520 NSCLC細(xì)胞的增殖和克隆。進(jìn)一步證實(shí)了Ephrin B2與腫瘤的生長(zhǎng)、分化之間的關(guān)聯(lián)。

綜上所述，Ephrin B2在肺癌中高表達(dá)，Ephrin B2與NSCLC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移存在關(guān)聯(lián)，抑制Ephrin B2的表達(dá)，能夠抑制NSCLC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移。Ephrin B2有望成為治療肺癌治療新的靶點(diǎn)。