黃 攀 徐 敏 何曉英

(德陽市人民醫(yī)院，德陽618000)

未破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤(Intracranial aneurysms,ICA)是指發(fā)生于顱內(nèi)動(dòng)脈管壁上的異常膨出。由于其發(fā)生破裂后具有極高的死亡率、致殘率，給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。因此，深入研究ICA的病理生理機(jī)制，對于有效預(yù)防ICA具有重要意義。研究顯示血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解平衡是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)生與否的決定性因素，而血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、金屬基質(zhì)蛋白酶-9(Matrix metalloproteinases,MMP-9)又是影響上述過程的關(guān)鍵調(diào)控因子[1,2]。

microRNA是一類長約17～22個(gè)核苷酸的非編碼小分子物質(zhì)，由于其表達(dá)穩(wěn)定，可在外周血中被穩(wěn)定檢測，近年來已成為多種疾病的生物學(xué)標(biāo)記物[3,4]。本研究前期通過生物學(xué)信息分析發(fā)現(xiàn)microRNA-126、microRNA-125b是VEGF、MMP-9的上游基因之一，且也有基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)microRNA-126、microRNA-125b的確可以通過調(diào)控VEGF及MMP-9進(jìn)而參與疾病的發(fā)生。然而，關(guān)于microRNA-126、microRNA-125b在未破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者外周血中的表達(dá)情況及二者與ICA的臨床特點(diǎn)、VEGF、MMP-9的關(guān)系尚不明確。因此，本研究通過對比檢測未破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤與正常患者外周血清中microRNA-126、microRNA-125b、VEGF、MMP-9的表達(dá)水平，并采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法初步探討ICA診斷與治療的潛在新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 選取2015年9月至 2017年12月在我院門診體檢或住院的顱內(nèi)未破裂動(dòng)脈瘤患者120例作為動(dòng)脈瘤組，另外選取同期健康者63例作為對照組。其中，動(dòng)脈瘤組中男64例，女56例，年齡34～78歲，平均(41.56±5.87)歲；對照組63例，男33例，女30例，年齡30～76歲，平均(42.13±5.91)歲。兩組資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。動(dòng)脈瘤組患者均符合未破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)相關(guān)科室兩名醫(yī)生確認(rèn)。兩組間性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有標(biāo)本均在患者知情同意下獲得，并獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)許可。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn) ①經(jīng)DSA、CTA或MRA檢查確診為未破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的患者；②首次確診為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤；③未進(jìn)行手術(shù)及藥物干預(yù)者；④無瘤體破裂者。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn) ①入院前已行動(dòng)脈瘤夾閉或血管內(nèi)治療；②臨床資料不完整者；③嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者；④存在造影劑過敏者；⑤妊娠或者哺乳期婦女者；⑥精神異常不能配合試驗(yàn)者。

1.2方法

1.2.1血清標(biāo)本的收集 清晨抽取患者空腹外周靜脈血樣本5 ml，放置于室溫下任其自然凝固10～20 min，然后將凝固的血液樣本3 000 r/min離心30 min，離心后仔細(xì)分離收集上層血清并儲存在-80℃超低溫冰箱，用于血清總RNA的提取及RT-PCR、ELISA。

1.2.2主要試劑 Trizol Reagent、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、10 mmol/L dNTP MIX(InvitrogenTM公司，美國)；SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司，美國)；VEGF試劑盒(由上海拜力生物科技有限公司代理 ，中國)；MMP-9試劑盒(武漢博美生物工程有限公司，中國)；microRNA-126、microRNA-125b 和U6引物均有武漢金開瑞生物工程有限公司合成。U6內(nèi)參序列(Forward:5′-CTCGCTTCGGCAGC-ACAT-3′；Reverse:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′)。microRNA-126序列(Forward:5′-TCGTACCGTGAGTAATAATGCG-3′；Reverse:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′)。microRNA-125b序列(For-ward:5′-CTTCCCTGAGACCCTAACTTGTG-3′；Rever-se:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′)。

1.2.3總RNA提取及RT-PCR 按照RNA提取的相關(guān)步驟進(jìn)行動(dòng)脈瘤組與對照組患者外周血清中總RNA的提取，按照RT-PCR技術(shù)進(jìn)行microRNA表達(dá)的檢測，每個(gè)樣本均獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。其中RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照如下條件進(jìn)行：65℃進(jìn)行預(yù)變性5 min，37℃進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄50 min，75℃進(jìn)行酶滅活15 min。以2.5 μl cDNA 配制 Real-time PCR體系，按如下條件進(jìn)行 PCR 反應(yīng):95℃進(jìn)行預(yù)變性1 min，變性 95℃ 15 s，退火延伸 58℃ 20 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以U6基因作為校正基數(shù)，ΔCt=目的基因Ct值-U6基因Ct值，本研究采用2-ΔCt法計(jì)算 microRNA-126及microRNA-125b的相對表達(dá)量。

1.2.4ELISA檢測VEGF和MMP-9 按照相關(guān)試劑盒操作說明書對兩組患者外周血清中VEGF及MMP-9的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

IndexICA groupControl groupPAge(year)<4038210.8240-6053270.73>6029150.95SexMale/Female64/5633/300.46ComplicationDiabetes1480.83Hypertension42230.84Hyperlipidemia57280.69Coronary disease740.88

2 結(jié)果

2.1兩組患者外周血清中microRNA-126、microRNA-125b表達(dá)水平比較 ICA組microNRA-126的表達(dá)水平高于對照組，而ICA組microRNA-125b表達(dá)水平低于對照組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖1。

2.2兩組患者外周血清中VEGF、MMP-9表達(dá)水平比較 ICA組VEGF、MMP-9的表達(dá)水平高于對照組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表2。

圖1 兩組患者microRNA-126、microRNA-125b表達(dá)水平比較Fig.1 Comparison of levels of serum microRNA-126,microRNA-125b in two Note: *.P<0.01.

GroupsnVEGF(pg/ml)MMP-9(ng/ml)Control group6398.56±33.2515.72±3.08ICA group120125.37±41.8680.08±17.52t4.4428.88P<0.01<0.01

表3 microRNA-126、microRNA-125b的表達(dá)水平與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者臨床特點(diǎn)的關(guān)系

Tab.3 Clinical correlation of microRNA-126,microRNA-125b expression in ICA

GroupsnmicroRNA-126t/FPmicroRNA-125bt/FPAge(year)0.640.521.550.121)<50723.13±0.981.80±0.34≥50483.24±0.811.89±0.26Sex0.590.551.870.061)Male643.22±0.971.79±0.33Female563.12±0.841.89±0.28MorphologyCystic683.12±0.930.190.901.83±0.330.220.882)Spindle253.26±1.031.87±0.27Dissection93.21±1.041.87±0.08Mixed form183.24±0.631.80±0.36SiteAnterior673.11±0.880.530.591.80±0.271.600.202)Posterior313.19±0.991.92±0.34Both223.34±0.931.84±0.37Number1863.06±0.923.56<0.011.91±0.29-4.21<0.011)≥2343.45±0.841.66±0.30Size<5 mm662.89±0.8510.670.011.97±0.28-19.00<0.012)5-10 mm313.29±0.921.75±0.29>10 mm233.82±0.731.58±0.25

Note：1)indicates the use ofttest；2)indicates the use of One-way ANOVA.

表4 microRNA-126、microRNA-125b與VEGF、MMP-9相關(guān)性

Tab.4 Expression correlation of microRNA-126,micro-RNA-125b and VEGF,MMP-9 in ICA

microRNA-126microRNA-125bVEGF0.7410.000-0.1680.067MMP-90.7870.000-0.7210.000

圖2 microRNA-126、microRNA-125b與VEGF、MMP-9相關(guān)性分析Fig.2 Expression correlation of microRNA-126,microRNA-125b and VEGF,MMP-9 in ICA

2.3microRNA-126、microRNA-125b與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者臨床特征的關(guān)系 顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者外周血清中microRNA-126、microRNA-125b的表達(dá)水平與年齡、性別、瘤體形態(tài)、瘤體部位無明顯關(guān)系(P>0.05)，而與瘤體數(shù)目、瘤體積大小相關(guān)(P<0.05)。見表3。

2.4microRNA-126、microRNA-125b的表達(dá)水平與VEGF、MMP-9表達(dá)水平的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析表明microRNA-126與VEGF、MMP均具有正相關(guān)性(P<0.01)；而microRNA-125b僅與MMP-9呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與VEGF無相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。見表4、圖2。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，75%的蛛網(wǎng)膜下腔出血是由ICA破裂引起的，由于ICA在破裂之前常無明顯癥狀、體征，該病可謂是嚴(yán)重威脅生命的“隱形殺手”[5]，因此，對于ICA做到早期發(fā)現(xiàn)、早期預(yù)防尤為重要。由于ICA的影像學(xué)檢查存在有創(chuàng)、耗時(shí)等缺點(diǎn)且在短時(shí)間內(nèi)無法改善，使得生化檢測技術(shù)逐漸受到人們的關(guān)注[6,7]。microRNA是一類長度約17～22個(gè)核苷酸的非編碼小分子物質(zhì)，其通過堿基互補(bǔ)配對的原則與靶基因mRNA結(jié)合進(jìn)而抑制相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄后翻譯從而發(fā)揮調(diào)控生長發(fā)育、疾病發(fā)生發(fā)展的過程[8]，由于其表達(dá)穩(wěn)定，近年來已成為多種疾病的生物學(xué)標(biāo)記物[9]。研究發(fā)現(xiàn)，ICA也存在著microRNA的差異表達(dá)譜[10]，有研究者通過對ICA病理取材標(biāo)本進(jìn)行基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)ICA中存在差異表達(dá)的microRNA多達(dá)32種，且通過生物學(xué)信息分析發(fā)現(xiàn)這些microRNA可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、平滑細(xì)胞增殖遷移、炎癥免疫細(xì)胞的增殖遷移等途徑參與ICA的發(fā)病[11-13]。本研究通過RT-PCR技術(shù)證實(shí)ICA患者外周血清microRNA-126的表達(dá)水平明顯高于無ICA人群，而microRNA-125b的表達(dá)水平明顯低于無ICA人群，且二者的表達(dá)水平與瘤體積大小、數(shù)目多少密切相關(guān)，提示microRNA-126、microRNA-125b與ICA的發(fā)病密切相關(guān)。

關(guān)于ICA的發(fā)病機(jī)制，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是由于顱內(nèi)動(dòng)脈管壁局部的先天性缺陷和腔內(nèi)壓力增高引起，傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素包括高血壓、腦動(dòng)脈硬化、血管炎等多種因素[14]，而新近研究發(fā)現(xiàn)，VEGF、MMP-9也參與了顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生。顱內(nèi)動(dòng)脈正常結(jié)構(gòu)的維持依賴于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成與降解保持平衡，此平衡的破壞是導(dǎo)致ICA發(fā)生的主要原因[15]。MMP-9作為最主要的細(xì)胞外基質(zhì)溶解酶之一，其過表達(dá)必然會引起ECM的降解加速，導(dǎo)致血管外膜中纖維連接薄弱，在血流剪切力的作用下加速ICA的形成[16]。Xiao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，ICA病理組織中MMP-9的表達(dá)水平明顯升高，且主要是在血管中膜及外膜上高表達(dá)。此外研究顯示，ICA病理組織中VEGF的陽性表達(dá)率增高，VEGF是一種強(qiáng)促血管生成因子，不僅可以促進(jìn)MMP-9的激活及轉(zhuǎn)錄[18]，還能促進(jìn)尿激酶型纖溶酶(UPA)的表達(dá)上調(diào)進(jìn)而間接發(fā)揮促ECM降解作用。本研究通過ELISA技術(shù)發(fā)現(xiàn)ICA患者外周血清中VEGF、MMP-9的表達(dá)水平明顯高于對照組，再次證實(shí)VEGF、MMP-9參與ICA的致病，與多數(shù)研究結(jié)論相似。

體外研究顯示，VEGF是microRNA-126的下游靶基因，microRNA-126可以通過多條信號通路調(diào)控VEGF的生成進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控血管生成的作用，因此microRNA-126被認(rèn)為是血管生成的關(guān)鍵調(diào)控因子。為進(jìn)一步探討microRNA-126在ICA致病中的分子機(jī)制，本研究通過microRNA-126與VEGF、MMP-9相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：microRNA-126與VEGF、MMP-9呈正相關(guān)，推測在ICA中過表達(dá)的microRNA-126可以通過促進(jìn)VEGF及MMP-9的分泌進(jìn)而參與ICA的致病。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)microRNA-125b與MMP-9呈負(fù)相關(guān)性，推測microRNA-125b可能通過負(fù)性調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)影響ICA的發(fā)生。目前關(guān)于microRNA-125b與MMP-9的調(diào)控機(jī)制尚無明確報(bào)道，僅在基礎(chǔ)試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)microRNA-125b具有調(diào)控MMP-9的作用，但其表達(dá)的高低與具體的調(diào)控機(jī)制存在爭議。然而受條件限制，本研究僅采用相關(guān)性分析的方法初步探討其可能的機(jī)制，并未進(jìn)行體外試驗(yàn)對上述推測進(jìn)行驗(yàn)證，因此，需待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步探究。

綜上所述，microRNA-126、microRNA-125b在ICA患者外周血清中存在差異表達(dá)譜，且二者的表達(dá)水平與ICA的臨床特點(diǎn)、VEGF、MMP-9具有密切關(guān)聯(lián)，但其具體機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步深入研究。