楊茜 肖炳坤 楊建云 黃榮清

摘 要 采用反相和陽離子交換雙重保留機理， 無需添加離子對和衍生化試劑， 建立了18種游離氨基酸的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用直接分析方法。采用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）系統(tǒng)， 使用OSAKA SODA CAPCELL PAK CR 1∶4 （150 mm × 2.1 mm， 5 μm; SCX∶C18=1∶4）色譜柱， 以0.1%甲酸（A）-乙腈（含0.1%甲酸）（B）-50 mmol/L甲酸銨（C）為流動相進行三元梯度洗脫， 對18種氨基酸進行分離檢測， 可得到良好的分析結(jié)果。色譜峰面積精密度（RSD）范圍為0.7%～5.9%; 標準曲線線性關(guān)系良好（R2=0.993～0.999）; 對SD大鼠血清和尿液樣品加樣回收率范圍為92.2%～113.6%。本方法流動相條件簡單， 靈敏度高， 可用于血清和尿液中游離氨基酸分析， 為生物樣品中氨基酸檢測或其它復雜基質(zhì)中氨基酸的檢測提供了新的方法和思路。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法; 氨基酸分析; 非衍生化生物樣品; 雙重保留機理

1 引 言

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)， 是生命活動中不可或缺的一類小分子物質(zhì)。對生物體內(nèi)氨基酸的分析研究， 有助于了解生命過程， 對于疾病的診斷[1，2]和藥物的研究[3，4]具有重要作用。

氨基酸的分離檢測技術(shù)一直是研究者的關(guān)注點之一， 盡管氨基酸分析方法多種多樣， 但改進現(xiàn)有方法， 使其具有更好的專屬性與靈敏度一直是研究的熱點和難點問題[5]?，F(xiàn)有分離方法包括毛細管電泳法、 氣相色譜法、液相色譜法等， 氨基酸分離后再通過熒光、紫外、蒸發(fā)光散射、質(zhì)譜等檢測器進行檢測。其中， 液相色譜是一種常用分離手段。在氨基酸的液相分離中， 由于氨基酸類物質(zhì)含有氨基和羧基兩種官能團， 一方面自身極性很強， 難以直接在反相C18色譜柱上得到良好保留， 另一方面紫外吸收弱， 生命體中常見的20種氨基酸中， 除酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸外， 均難以在紫外檢測器（UV）上得到高靈敏響應(yīng)。為了改善氨基酸的保留與檢測問題， 通常使用衍生化試劑在柱前或柱后對氨基酸進行衍生。從最初的茚三酮比色分析[6]方法， 到現(xiàn)階段常用的鄰苯二甲醛（OPA）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）、6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯（AQC）、異硫氰酸苯酯（PITC）等衍生化試劑， 均能很好地改善氨基酸在液相色譜分析中保留差、吸收弱的缺點， 建立在線或離線的液相色譜分析方法[7～12]。但衍生化試劑的引入， 對衍生環(huán)境條件及氨基酸結(jié)構(gòu)要求高， 如OPA只對一級氨基酸具有衍生作用， Dansyl-Cl、PITC衍生速度慢， 操作方法繁瑣， 相對重現(xiàn)性較差[13～16]。對于生物樣品分析， 衍生化試劑的引入會將原本就復雜的體系進一步復雜化， 增加解析的難度。

近年來， 質(zhì)譜技術(shù)的高速發(fā)展在一定程度上滿足了氨基酸高靈敏檢測的需求。氨基酸容易離子化， 在電噴霧源（ESI）正離子模式下能夠得到很好的響應(yīng)[17]， 同時由于質(zhì)譜檢測的信號為質(zhì)荷比（m/z）， 即使未能達到基線分離的情況， 也可通過不同質(zhì)荷比進行定量分析[18]， 因此在氨基酸的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）分析中， 氨基酸在色譜柱上的保留成為關(guān)鍵。目前， 氨基酸的LC-MS分析方法多通過衍生化或添加離子對試劑改善其保留行為， 如在流動相中添加七氟丁酸、九氟戊酸等揮發(fā)性離子對試劑[19]， 但該類物質(zhì)的加入又會在一定程度上影響質(zhì)譜離子源的離子化[20]。為了改善氨基酸在LC-MS上的保留問題， 諸多新機理的色譜柱被應(yīng)用， 如使用石墨化碳（Hypercarb）柱可將氨基酸由酸性至堿性順序洗脫[21，22]; 使用親水性相互作用（HILIC）柱可將極性氨基酸良好保留[23]等。雙重機理色譜同樣也可作為氨基酸分析的全新分離保留手段[24]， Choi等[25]利用固定相中嵌入親水性和陽離子交換配體的混合型柱對尿液中的氨基酸進行了分析。本研究引入陽離子交換和反相作用雙重機理， 通過陽離子交換作用對氨基酸的氨基部分進行保留， 同時通過反相作用對疏水性差異進行識別， 增強分離能力。最終在LC-MS上僅使用甲酸-乙腈-甲酸銨的簡單分析體系， 無需衍生化和添加離子對試劑， 實現(xiàn)了18種氨基酸的高靈敏定量分析， 并采用此方法測定了SD大鼠血清和尿液中的氨基酸含量。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Nanospace 高效液相色譜儀系統(tǒng)， 配備脫氣機， 二元高壓泵， 高壓單泵， 高精度自動進樣器NASCA， 柱溫箱（日本Osaka Soda公司）; QTRAP 5500 三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國SCIEX公司）; ML204/02萬分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）; Fungilab超聲波儀（西班牙Fungilab公司）; Centrifuge H-501FR離心機（日本Kokusan公司）; Milli-Q UltrapUre Ion-Ex-TM超純水機（美國Millipore公司）。

乙腈、甲酸、甲酸銨（色譜純， 北京百靈威公司）; 18種氨基酸標準品：甘氨酸（批號140689-201605）、丙氨酸（批號140680-201604）、脯氨酸（批號140677-201507）、纈氨酸（批號140681-200401）、蘇氨酸（批號140682-201302）、亮氨酸（批號140687-201503）、異亮氨酸（批號140683-201302）、組氨酸（批號140693-201803）、苯丙氨酸（批號140676-201706）、精氨酸（批號140685-201003）、酪氨酸（批號140609-201513）購于中國藥品生物制品檢定所; 絲氨酸（批號20121017）天冬氨酸（批號20130717）、天冬酰胺（批號20130308）、賴氨酸（批號20131104）、谷氨酸（批號20130717）、甲硫氨酸（批號20130702）和色氨酸（批號20130418）購于國藥集團化學試劑有限公司。實驗用水為Milli-Q系統(tǒng)制備的超純水。

2.2 實驗方法

2.2.1 色譜條件 采用CAPCELL PAK CR 1∶4（150 mm×2.1 mm， 5 μm）色譜柱（日本Osaka Soda公司）， 流動相為0.1%甲酸（A）-乙腈（含0.1%甲酸）（B）-50 mmol/L甲酸銨（C）， 采用梯度洗脫： 0～3.0 min， 100% A， 0.2 mL/min; 3.0～10.0 min， 100%～30% A， 0%～70% B， 0.2～0.3 mL/min; 10.0～15.0 min， 0%～100% C， 0.3 mL/min; 15.0～20.0 min， 100% C， 0.3 mL/min; 20.0～20.1 min， 0%～100% A， 0.3 mL/min; 20.1～30.0 min， 100% A， 0.3 mL/min。柱溫35℃， 進樣量2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 Turbo-V電噴霧離子源， 采用正離子模式檢測， 噴霧電壓5500 V， 離子源溫度400℃， 噴霧氣體（GAS1）20 psi， 干燥氣體（GAS2）20 psi， 氣簾氣（Curtain GAS）20 psi。采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式， 入口電壓（EP）10 V， 碰撞室出口電壓（CXP）10 V， 各個物質(zhì)母離子、子離子、去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）等參數(shù)見表1。

2.2.3 樣品制備? （1）混合對照品溶液的制備 分別稱取甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸標準品， 精密稱定后， 酪氨酸和天冬氨酸使用0.1% （V/V）氨水溶解， 苯丙氨酸使用50% （V/V）乙腈溶解， 其余氨基酸均使用超純水溶解， 制成對照品儲備液。分別移取適量對照品儲備液， 加流動相A稀釋成混合對照品溶液（甘氨酸3.08 μg/mL、丙氨酸0.5 μg/mL、絲氨酸0.6 μg/mL、脯氨酸0.1 μg/mL、纈氨酸0.15 μg/mL、蘇氨酸0.8 μg/mL、亮氨酸0.145 μg/mL、異亮氨酸0.145 μg/mL、天冬氨酸0.115 μg/mL、天冬酰胺0.9 μg/mL、賴氨酸0.2 μg/mL、谷氨酸0.7 μg/mL、甲硫氨酸0.550 μg/mL、組氨酸0.275 μg/mL、苯丙氨酸0.140 μg/mL、精氨酸0.7 μg/mL、酪氨酸0.2 μg/mL、色氨酸0.375 μg/mL）， 搖勻， 備用。（2）實驗動物 雄性SD大鼠6只， 飼養(yǎng)室光照12 h， 黑暗12 h， 模擬正常環(huán)境， 室溫（25±2）℃， 相對濕度35%～45%。適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后， 常規(guī)飼料飼養(yǎng)一周， 自由飲水， 置于代謝籠中收集12 h尿液后， 第二日腹主動脈取血， 12000 r/min離心后獲得血清。（3）血清樣品前處理 取血清50 μL， 加入200 μL超純水， 振蕩30 s后超聲10 min， 取50 μL， 加入200 μL乙腈沉淀蛋白， 再次振蕩并超聲， 12000 r/min離心15 min， 上清液過0.22 μm濾膜， 用流動相A稀釋10倍， 待上樣分析。（4）尿液樣品前處理 取200 μL尿液， 12000 r/min離心5 min， 取50 μL上清液， 加入200 μL超純水， 振蕩30 s后超聲10 min。取50 μL， 加入200 μL乙腈沉淀蛋白， 再次振蕩并超聲， 12000 r/min離心15 min， 上清液過0.22 μm濾膜， 使用流動相A稀釋10倍， 待上樣分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 保留模式的選擇

為了實現(xiàn)氨基酸類物質(zhì)在液相色譜柱上的良好保留， 考察了不同機理色譜柱的保留能力。首先使用反相模式C18色譜柱（CAPCELL PAK C18 MGIII 150 mm × 2.1 mm， 5 μm）進行分析， 3 min內(nèi)以0.1%甲酸進行反相保留， 在隨后的12min逐漸添加有機相乙腈至80%比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸以外的氨基酸保留時間均不足2min， 出峰均在死時間附近， 因此使用反相色譜柱在不衍生、不添加離子對試劑的情況下， 無法將大多數(shù)氨基酸良好保留。

氨基酸為兩性化合物， 通過調(diào)整pH值可使其帶正電荷或負電荷， 因此可使用離子交換模式進行保留。本研究考察了直接使用陽離子交換型SCX（CAPCELL PAK SCX 150 mm×2.1 mm， 5 μm）色譜柱進行分析的效果。在陽離子交換機理下， 反相機理中無法保留的甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、谷氨酸得到保留， 但出峰時間均較為接近， 堿性氨基酸（組氨酸、精氨酸和色氨酸）由于保留過強， 在50 mmol/L甲酸銨緩沖鹽條件下無法洗脫。因此， 考慮將反相和陽離子交換機理相結(jié)合， 通過一定的陽離子交換作用實現(xiàn)氨基酸的保留， 同時在反相機理的參與下也更有利于氨基酸分離與洗脫。色譜柱選擇混合填料型（混合比SCX∶C18=1∶4）的CAPCELL PAK CR 1∶4（150 mm×2.1 mm， 5 μm）與鍵合型（硅膠球孔內(nèi)鍵合反相和陰離子交換特性的固定相， 硅膠球間鍵合陽離子交換的固定相）Acclaim Trinity P1（100 mm×3.0? mm， 5 μm）兩種同時具有離子交換與反相作用的色譜柱進行比較分析。在離子交換和反相雙重機理作用下， CR或P1色譜柱對極性氨基酸的保留時間均延長至3 min以上， 雙重機理CR色譜柱和反相C18色譜柱的保留時間對比見表2， 在雙重機理模式作用下， C18色譜柱無法保留的天冬酰胺、天冬氨酸、絲氨酸等氨基酸均獲得了良好保留， 實現(xiàn)了氨基酸的非衍生化法直接保留。由于P1色譜柱對精氨酸、組氨酸和苯丙氨酸峰型拖尾， 峰寬超過2 min， 最終選擇CR色譜柱進行了分析方法建立。

3.2 流動相的選擇和梯度條件優(yōu)化

在雙重保留機理色譜柱上， 對于反相疏水作用使用乙腈（B）為洗脫溶劑， 對于離子交換作用使用甲酸銨（C）作為洗脫溶劑， 在三元梯度條件下進行方法建立?？疾旒姿徜@濃度在10、25和50 mmol/L時的洗脫效果， 結(jié)果表明， 使用10和25 mmol/L甲酸銨， 無法將組氨酸和精氨酸洗脫， 因此最終選擇使用50 mmol/L甲酸銨作為洗脫溶劑。x3.3 回收率及提取條件優(yōu)化

對血清和尿液樣品添加標準品后（添加濃度： 甘氨酸3.0 μg/mL、丙氨酸50.0 μg/mL、絲氨酸60.0 μg/mL、 脯氨酸10.0 μg/mL、纈氨酸15.0 μg/mL、蘇氨酸80.0 μg/mL、亮氨酸14.5 μg/mL、異亮氨酸14.5 μg/mL、天冬氨酸11.5 μg/mL、天冬酰胺9.0 μg/mL、賴氨酸20.0 μg/mL、谷氨酸7.0 μg/mL、甲硫氨酸5.5 μg/mL、組氨酸27.5 μg/mL、苯丙氨酸14.0 μg/mL、精氨酸70.0 μg/mL、酪氨酸20.0 μg/mL、色氨酸37.5 μg/mL）， 按照2.2.3節(jié)方法進行前處理， 血清樣品加樣回收率為92.2%～113.6%; 尿液樣品加樣回收率為95.2%～109.3%。

在加標回收實驗中發(fā)現(xiàn)， 若直接使用乙腈沉淀血清和尿液中的蛋白， 會導致溶解度低的氨基酸回收率較差， 如谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸用此方法的回收率約為80%。為了避免前處理過程中可能的氨基酸損失， 優(yōu)化了前處理方案， 采取先加4倍量水到血清（尿液）中進行稀釋并提取氨基酸后， 再加入乙腈沉淀蛋白。通過改善前處理方法， 血清的加標回收率由76.1%～96.9%上升至92.2%～113.6%， 尿液加標回收率由75.5%～101.6%上升至95.2%～109.3%。

3.4 線性范圍、定量限和精密度

4 結(jié) 論

使用反相和離子交換雙重機理型色譜柱， 在不衍生化、不添加離子對試劑的簡單條件下， 實現(xiàn)了18種氨基酸的LC-MS/MS分離和定量測定。本方法操作簡單， 靈敏度高， 雖然目前尚未將同分異構(gòu)體氨基酸良好分離（如亮氨酸和異亮氨酸）， 但此方法為生物樣品中氨基酸檢測或其它復雜基質(zhì)中游離氨基酸的檢測提供了新的方法和思路。

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