門婷婷+劉晨+劉珂飛

摘 要：建立雞肉和雞蛋中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星殘留檢測(cè)的UPLC-MS/MS方法。樣品采用2%甲酸乙腈溶液兩部提取之后氮吹的方法，HESI源正離子模式掃描，在選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（SRM）下進(jìn)行特征母-子離子對(duì)信號(hào)采集。根據(jù)保留時(shí)間和母離子及兩個(gè)特征子離子信息進(jìn)行定性分析，9 min內(nèi)完成4種氟喹諾酮沙星類藥物的定量分析。結(jié)果顯示，方法檢測(cè)底限為0.5 μg·kg-1，在10，20，40 μg·kg-1添加水平下，雞肉加標(biāo)回收率在70%～90%，雞蛋加標(biāo)回收率在80%～100%，且兩種樣本RSD值均<10%。該方法前處理簡(jiǎn)便快速，分析速度快，靈敏度高。

關(guān)鍵詞：氟喹諾酮類藥物；超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法；雞蛋；雞肉

中圖分類號(hào)：S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.06.009

Abstract： The paper established the UPLC-MS/MS method to determine the residues of norfloxacin，ciprofloxacin，enrofloxacin，ofloxacin in the chickens and eggs. The samples were extracted by 2%formic acid in acetonitrile for two times and blow dry through termovap sample concentrator. The samples was positive ion mode scanning by heated electro spray ionization（HESI）， and the signal collection of characteristic maternal ions and sub-ion pairs was conducted by the selective reaction monitor（SRM）. The qualitative analysis was conducted on the basis of retaining time， maternal ions and the two characteristic sub-ion， and the quantitative analysis of chloramghenicol was conducted in 9 minutes. On the condition that the detection limit was 0.5 μg·kg-1 and 10，20，40 μg·kg-1 addition level， the recovery rate in chickens and eggs was 70%～90% and 80%～100% respectively， and the RSD between the two kinds of samples was less than 10%. The methods had the advantage of simple and fast on the pretreatment， quick analysis and high sensitivity.

Key words： fluoroquinolones drug； UPLC-MS/MS； chicken； eggs

氟喹諾酮類抗生素是一類人畜通用的藥物。因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性和毒副作用小等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)中，包括在雞、鴨、鵝、豬、牛、羊、魚、蝦、蟹等的養(yǎng)殖中用于疾病防治[1]。由于氟喹諾酮類藥物在動(dòng)物機(jī)體組織中的殘留，人食用動(dòng)物組織后氟喹諾酮類抗生素就在人體內(nèi)殘留蓄積，易造成人體疾病對(duì)該藥物的嚴(yán)重耐藥性，影響人體疾病的治療，從而影響該類藥物的臨床療效[2]。因此，氟喹諾酮類藥物殘留問題越來越引起人們的關(guān)注。目前，有多種檢測(cè)氟喹諾酮類藥物殘留的方法[3-7]，其中包括液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫試劑盒、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法等。本研究建立了檢測(cè)雞蛋和雞肉中4種常見氟喹諾酮類藥物的多殘留檢測(cè)方法，采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法，能簡(jiǎn)便、快速地對(duì)雞肉和雞蛋進(jìn)行定量分析檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 儀 器

超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀：Thermofisher Dionex Ultimate 3000 RSLC - TSQ QUANTUM ACCESS MAX，配有電噴霧離子源（HESI源）；瑞寧微量移液器；VDRTEX-5-H106漩渦混合器（江蘇其林貝爾）；GL-20G-II高速冷凍離心機(jī)（上海安亭）；TTL-DCI氮吹儀（北京同泰聯(lián)）；超純水儀（MILLIPORE Synergy）

1.2 藥品和試劑

諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。乙腈、甲酸、正己烷為色譜純，購于美國Thermofisher公司，試驗(yàn)用水由 MILLIPORE Synergy制得。

1.3 檢測(cè)條件和方法

1.3.1 液相色譜與質(zhì)譜條件 液相色譜柱：Hypersil Gold-C18，1.9 μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相，0.1%甲酸水-甲醇；流速0.35 mL·min-1；進(jìn)樣量，10 μL。流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.1%甲酸水；0～1.5 min，A為10%，B為90%；1.5～5.5 min，A由10%變化至90%，B由90%變化至10%；5.5～7 min ，A為90%，B為10%；7～9 min，A為10%，B為90%。

質(zhì)譜掃描方式：正離子掃描，檢測(cè)方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電噴霧電壓，3 800 V；霧化溫度，400 ℃；輔助氣流速10 arb ；鞘氣流速，35 arb；毛細(xì)管溫度，350 ℃。質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取4種沙星類標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加乙腈至100 mL，制成100 μg·mL-1的溶液，做為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，-4 ℃冰箱保存。儲(chǔ)備液繼續(xù)用流動(dòng)相初始溶液稀釋成100 ng·mL-1，做為對(duì)照工作液使用。

1.3.3 樣品提取和凈化 前處理過程：準(zhǔn)確稱取雞肉、雞蛋粉碎樣品5 g（精確至0.01 g），置于50 mL具塞聚四氟乙烯離心管中，準(zhǔn)確加入10 g預(yù)先灼燒后的無水硫酸鈉，并用玻璃棒攪勻，然后加入20 mL2%甲酸乙腈。用玻璃棒混勻均質(zhì)提取5 min，5 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液置于離心管中，另取20 mL 2%甲酸乙腈到另一50 mL離心管中，并清洗玻璃棒，清洗液倒入第一個(gè)離心管中對(duì)雞肉進(jìn)行重復(fù)提取，合并兩次提取液并渦旋混勻。

凈化過程：將前處理提取液取出8 mL在55 ℃下氮吹吹干，加入2 mL流動(dòng)相初始溶液進(jìn)行渦動(dòng)溶解，溶解后加入1 mL10%甲醇飽和的正己烷渦旋混合30 s，8 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，用10%甲醇飽和的正己烷重復(fù)凈化2～3次，直至下層透明清亮，取出下層過0.2 μm有機(jī)濾膜置2 mL樣品瓶中供UPLC-MS/MS測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相條件的選擇 本試驗(yàn)對(duì)比了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相進(jìn)行對(duì)比選擇。結(jié)果表明，有甲酸存在的流動(dòng)相體系對(duì)氟喹諾酮類抗生素具有較好的分離能力且對(duì)出峰時(shí)產(chǎn)生的拖尾現(xiàn)象有較好的改善，證明流動(dòng)相中加入甲酸能提高質(zhì)譜的檢測(cè)靈敏度，增加樣品離子化效率。在對(duì)甲醇和乙腈的選擇上，考慮到試劑本身的性價(jià)比問題，流動(dòng)相體系選擇甲醇-0.1%甲酸水就完全可以滿足試驗(yàn)的要求。在流動(dòng)相比例調(diào)整過程中發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相短時(shí)間內(nèi)變化比較大的情況下，出峰峰形效果越好，對(duì)峰形的毛刺、拖尾的現(xiàn)象越有明顯改善，在計(jì)算峰形面積時(shí)，不經(jīng)過平滑即可得到可靠的數(shù)據(jù)。

2.1.2 質(zhì)譜條件的選擇 對(duì)4種沙星進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化，在正離子模式條件下得到最佳離子碰撞能量和Tube Lens值。在電噴霧電壓、霧化溫度、輔助氣流和毛細(xì)管溫度等質(zhì)譜參數(shù)的不同變化的情況下，比較樣品出峰情況和信號(hào)響應(yīng)值，最終得到最佳條件分別為電噴霧電壓3 800 V；霧化溫度400 ℃；輔助氣流速10 arb ；鞘氣流速35 arb；毛細(xì)管溫度350 ℃。具體TIC圖見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性考察

取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相初始溶液對(duì)4種沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行混合并稀釋成系列濃度為0.5，1，2，4，8 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，從低濃度到高濃度進(jìn)行測(cè)定，每一濃度進(jìn)樣3針，按其所得峰面積與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線（表2），并依次計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，最后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 添加回收和精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取100，200，400 μL對(duì)照工作液加入到5 g樣品中，每個(gè)添加濃度制備3份平行樣，每份樣品進(jìn)樣3次，取平均值。核算9個(gè)回收率測(cè)定結(jié)果并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

由表3知：雞肉中4種氟喹諾酮抗生素陽性添加樣品的回收率普遍在70%～90%，批間內(nèi)變異系數(shù)均<10%；雞蛋中4種氟喹諾酮抗生素陽性添加樣品的回收率普遍在80%～100%，批間內(nèi)變異系數(shù)均<10%。向?qū)嶋H樣品添加氟喹諾酮抗生素標(biāo)樣來確定本方法的檢測(cè)底限，考慮到樣品基質(zhì)的干擾性及信噪比要求，經(jīng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)確定本方法的檢測(cè)底限（LOQ）為0.5 μg·kg-1。

3 結(jié) 論

本文建立了測(cè)定雞蛋、雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留的UPLC-MS/MS方法。通過樣品前處理以及儀器的各項(xiàng)參數(shù)的優(yōu)化，找出了最佳的樣品提取方法，并使儀器檢測(cè)靈敏度達(dá)到最優(yōu)化。該方法的檢測(cè)底限（LOQ）為 0.5 μg·kg-1，同時(shí)樣品前處理時(shí)省去了凈化過程，具有處理程序簡(jiǎn)單、快速、測(cè)定準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)。

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