冉旭東 吳遠根

摘 要 核酸適配體具有類似蛋白抗體的性質(zhì)，在靶標特異性識別與檢測中引起越來越廣泛的關(guān)注。小分子物質(zhì)通常與環(huán)境污染和人類健康密切相關(guān)，然而小分子物質(zhì)與核酸文庫在性質(zhì)上差異較小，在篩選過程中沒有足夠的活性位點，難以固定，因而其核酸適配體篩選難度更大。本研究采用體外合成一條生物素修飾的堿基序列，通過氫鍵與隨機文庫3′-末端進行互補配對，將其固定在鏈霉親和素修飾的納米磁珠上。隨后，加入不同濃度的百草枯靶分子孵育，洗脫得到百草枯特異性的親和性ssDNA，對其進行非對稱PCR擴增后，得到下一輪篩選所需的富集ssDNA庫。經(jīng)過9輪篩選后，將所得親和性ssDNA進行克隆測序，最終得到15條百草枯的親和ssDNA序列。對親和性序列進行聚類分析和二級結(jié)構(gòu)預測，再根據(jù)同源性等條件從中篩選出6條ssDNA序列進行親和力測定。結(jié)果表明，PQ-15序列對百草枯的親和力最高，解離常數(shù)（Kd）為（54±4） nmol/L。最后，利用PQ-15核酸適配體作為百草枯的識別分子，以陽離子化合物聚集的納米金作為傳感信號，建立了基于核酸適配體識別的百草枯農(nóng)藥比色檢測方法，檢出限為25.2 nmol/L，其它競爭性分子對百草枯檢測無明顯干擾，實際樣品中百草枯的加標回收率為91.1%～99.6%。

關(guān)鍵詞 核酸適配體; 百草枯; 篩選; 比色檢測; 納米金

1 引 言

百草枯（1，1-二甲基-4，4-二吡啶二氯）是一種具有雙苯環(huán)結(jié)構(gòu)、極性很強的有機小分子，是毒性最強的除草劑之一，在水中溶解度極高[1]。由于生產(chǎn)成本較低、除草效率高，因而被廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，曾在一些發(fā)展中國家廣泛使用[2]。百草枯在食品中最大殘留限量為0.05 mg/kg[3]，其毒性與二價陽離子還原及自由基有關(guān)，可引起細胞膜、蛋白質(zhì)和DNA的損傷，從而對環(huán)境和人類健康造成潛在的威脅[4]。目前，由于缺乏特定的解毒劑和有效的治療方法，已有數(shù)萬例因百草枯中毒死亡病例報告。我國自2014年7月1日起撤銷了百草枯水劑登記和生產(chǎn)許可，2016年7月1日全面停止水劑銷售和使用，但仍有一些固體藥物生產(chǎn)和非法使用。所以， 百草枯的檢測方法與治療方法的研究對保護消費者健康具有重要意義。

核酸適配體是指具有10～100個堿基和特定復雜三維結(jié)構(gòu)的單寡鏈核苷酸，1990年由Szostak[5]和Gold[6]等通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX） 技術(shù)篩選獲得。核酸適配體與靶標能發(fā)生特異性結(jié)合，親和力極高，其結(jié)合解離常數(shù)通?？梢赃_到納摩爾和皮摩爾級[7]。小分子有害污染物與人類健康密切相關(guān)，但針對小分子靶標的核酸適配體篩選方法還存在許多不足，如受到靶標分子量以及材料特性制約，篩選平臺自動化程度不高、隨機性較大，針對不同的靶標需不同的篩選策略。通常，核酸適配體篩選成功與否主要取決于靶標與ssDNA孵育結(jié)合及后續(xù)的分離純化[8]。研究人員建立了一些新的篩選技術(shù)，如毛細管電泳（CE）[9]、流式細胞儀（FC）[10]、表面等離子體共振（SPR）[11]、磁珠分離法[12] 、微流控篩選法[13]、氧化石墨烯[14]等，主要對SELEX程序進行了改進，以便快速、簡單地篩選與各種靶標及其類似物結(jié)合的核酸適配體[15]。隨著近些年來核酸適配體篩選技術(shù)的快速發(fā)展，研究人員已經(jīng)篩選出針對生物毒素、重金屬、抗生素、農(nóng)藥等小分子的核酸適配體，其中農(nóng)藥類核酸適配體主要有啶蟲脒[16]、莠去津[17]、甲拌磷、水胺硫磷、氧化樂果[18]、苯噻草胺、戊唑醇、抗倒胺[14]、氟蟲腈[19]，但針對百草枯核酸適配體的篩選及檢測目前還未見報道。針對百草枯的檢測方法主要有免疫分析法[20]、高效液相色譜法[21]、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[22]、高效毛細管電泳法[23]等。這些檢測方法使用儀器價格昂貴，樣品前處理繁雜，檢測時間長，且需要專門的操作人員，不利于現(xiàn)場實時檢測，所以有必要建立一種百草枯快速靈敏的檢測方法。

本研究在課題組前期報道的篩選方法[8]基礎上加以改進，采用磁分離技術(shù)對親和性ssDNA序列有效分離，采用非對稱PCR進行擴增，經(jīng)過9輪篩選后，成功獲得15條百草枯的親和ssDNA序列，并通過一系列測定，從中挑選出親和力最強的序列作為識別分子，建立了一種基于核酸適配體和陽離子聚合物聚集納米金比色技術(shù)的百草枯快速檢測方法。此檢測方法具有快速、可裸眼辨別、靈敏度高、成本低且易操作的優(yōu)勢。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

PTC-200型PCR儀（美國MJ RESEARCH公司）; PowerPa伯樂小型電泳儀（美國BIO-RAD公司）; Milli-Q plus型恒溫孵育器（Millipore Inc， Bedford， MA）; 多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）; 高速冷凍離心機（美國Sigma公司）。

隨機單鏈寡核苷酸庫5′-ACCGACCGTGCTGGACTCT-N30-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3′、PCR引物P1（5′-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3′）、P2（5′-CGCAACGCTCGCTCATACT-3′）、生物素標記的寡聚核苷酸序列P3（5′-Biotin-CGCAACGCTCGC-3′）、寡聚核苷酸純化試劑盒、非變性電泳凝膠試劑盒、PCR擴增試劑盒、Marker、純化回收試劑盒和5×TBE（上海生工生物工程股份有限公司）; 鏈霉親和素磁珠（南京先豐納米材料科技有限公司）; 雙丙烯酰胺（Bis）、丙烯酰胺（Acr）、過硫酸銨、異丙醇、溴酚藍、AgNO3、甲醛溶液、百草枯標準液（濃度為100 μg/mL）、檸檬酸三鈉、氯金酸（HAuCl4）、聚二烯二甲基氯化銨（PDDA）、3-（N-嗎啡啉）丙磺酸（MPOS）等（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）; NaCl、Tris·HCl、KCl、MgCl2·6（H2O）、CaCl2 、Tween-20和甘油等化學試劑均為市售分析純，購于上海國藥集團化學試劑公司; 實驗用水均為雙蒸水。

2.2 實驗方法

2.2.1 核酸適配體的體外篩選步驟 百草枯核酸適配體的篩選步驟：（1） 隨機ssDNA的固定 取3 nmol的隨機ssDNA庫，按摩爾比1∶2與P3序列混合，95℃退火5 min，30℃孵育60 min，使隨機文庫的3'端12個堿基序列與P3通過氫鍵互補配對。將配對后的混合液移入裝有磁珠的離心管中，30℃孵育60 min， 由于磁珠表面接有鏈霉親和素，通過生物素-親和素作用，將隨機文庫固定在磁珠上。用Binding 緩沖液（BB， 100 mmol/L NaCl， 20 mmol/L Tris-HCl， 5 mmol/L KCl， 2 mmol/L MgCl2， 1 mmol/L CaCl2， 0.02% Tween-20，pH=7.4）洗滌，除去未固定的隨機文庫和P3。（2）ssDNA序列的洗脫 在第1輪篩選時，取終濃度為500 μmol/L的百草枯溶液加入到固定隨機文庫的磁珠中。為了使靶標百草枯與固定的隨機文庫充分作用，進一步提高適配體篩選成功率，根據(jù)文獻[18]報道，本實驗將百草枯農(nóng)藥與固定的隨機序列輕微振蕩5 min混勻，30℃孵育60 min后，于4℃過夜孵育。將上述磁珠用磁鐵充分分離，收集百草枯洗脫的ssDNA上清液，用酶標儀測定吸光度，計算洗脫率。在后續(xù)的SELEX篩選過程中，百草枯終濃度由500 μmol/L逐漸減少至50 μmol/L，其它操作與第1輪均相同。（3）非對稱PCR擴增 利用本課題組前期優(yōu)化的非對稱PCR程序，擴增百草枯洗脫的親和性序列。反應溶液體系按照下述配方配制。PCR擴增反應液500 μL，包含200 μL模板鏈（即百草枯親和性ssDNA序列）、37.5 μL 10 μmol/L P1引物、7.5 μL 1 μmol/L P2引物和250 μL 2X PCR Master，將上述反應液用無菌ddH2O補加至500 μL，混合均勻后，等量分裝到10個PCR管中，進行PCR擴增。非對稱PCR擴增條件為： 94℃，3 min （變性）; 20個快速三階段PCR循環(huán)（94℃，45 s; 51℃，30 s; 72℃，20 s）; 在72℃延伸反應5 min。（4）凝膠電泳分離和ssDNA純化回收 經(jīng)非對稱PCR擴增后，取每輪的擴增產(chǎn)物9 μL，各加入1 μL溴酚藍上樣緩沖液混勻，1×TBE作為電泳緩沖液，用16%的非變性PAGE凝膠進行電泳分離，電壓控制在100～120 V。電泳結(jié)束后， PAGE膠銀染。在下一輪百草枯核酸適配體篩選實驗前，利用寡聚核苷酸純化試劑盒對本輪得到的PCR擴增液進行純化。

2.2.2 百草枯核酸適配體克隆測序及二級結(jié)構(gòu)預測 經(jīng)過9輪的SELEX篩選，對最后收集到的百草枯親和性序列進行PCR擴增，并將擴增反應液送到上海生工生物股份有限公司進行純化和克隆測序。所有測序的序列用MEGA（Molecular evolutionary genetics analysis）軟件制作發(fā)育樹，二級結(jié)構(gòu)通過http：//mfold.rna.albany.edu/網(wǎng)站進行預測。

2.2.3 核酸適配體解離常數(shù)（Kd）的測定 根據(jù)同源性及二級結(jié)構(gòu)等綜合分析，選出一些百草枯親和序列進行FAM熒光標記。然后分別配制10 μmol/L的適配體親和序列與20 μmol/L生物素標記的P3序列，按照摩爾比1∶2混勻、變性后，60℃孵育60 min。用250 μL BB緩沖液洗滌磁珠3次，用200 μL BB緩沖液重懸磁珠，備用。將親和序列替代隨機文庫作為對照，取重懸的磁珠分別與P3和適配體親和序列雜交溶液進行混合孵育120 min。用BB緩沖液洗滌除去未固定的親和序列和P3，總體積控制在1500 μL。測定收集洗脫液的熒光強度，并計算親和序列的固定量（X）。將上述固定有親和序列的磁珠分散到適量BB溶液中，取終濃度為100 μmol/L靶標溶液，與固定了百草枯親和序列的磁珠在60℃孵育120 min， 4℃過夜孵育，洗脫。取200 μL上清液，放入黑色酶標板中，測定洗脫液的熒光強度，計算得到與百草枯結(jié)合并被洗脫下的親和序列濃度（Y）。通過Origin8.0軟件進行曲線擬合，擬合公式為 Y=BmaxX/（Kd+X）， 其中，Y為核酸與靶標的復合物濃度; X為固定的核酸濃度; Bmax為常數(shù); Kd為解離常數(shù)（親和系數(shù)）。

2.2.4 AuNPs比色法檢測百草枯 （1）納米金的制備 利用“檸檬酸三鈉還原氯金酸法”制備納米金[24]。稱取 33.98 mg HAuCl4·xH2O 和114.11 mg 二水檸檬酸三鈉，分別溶解在100 和10 mL雙蒸水中。加熱氯金酸溶液至沸騰，在劇烈攪拌過程中迅速加入10 mL的檸檬酸三鈉溶液，保持加熱15 min，溶液由淡灰色變成藍色，再漸變?yōu)樽仙?，直至變?yōu)榉€(wěn)定的酒紅色后，停止加熱。持續(xù)攪拌15 min，冷卻至室溫。將上述溶液用250 nm孔徑的超濾膜進行過濾，濾液于棕色瓶中在4℃儲存，備用。（2） 基于AuNPs比色檢測百草枯 選取親和性最高的序列作為百草枯的識別分子，參照課題組前期建立檢測方法[25]，以陽離子化合物聚集納米金為傳感信號，比色檢測百草枯。在整個傳感體系中，PDDA和適配體濃度對納米金聚集具有調(diào)控作用，因此需對體系中的PDDA和適配體用量進行優(yōu)化。分散態(tài)的納米金在520 nm有最大吸收峰，聚集時在650 nm有最大吸收峰，因此取200 μL反應液放入96孔板中用酶標儀，測定吸光值A520 nm和A650 nm，以A650/520表示納米金聚集程度，靶標與空白組A650/520的差值△A650/520作為檢測信號。（3）百草枯核酸適配體的性能分析 將親和性最強的序列與不同濃度的百草枯孵育，在優(yōu)化的條件下進行靈敏度測定。隨后選取甲拌磷、啶蟲脒、敵敵畏、辛硫磷、丙溴磷、甲基對硫磷作為競爭性靶標，驗證本方法對百草枯檢測的特異性，對比各自顏色變化情況，記錄各類靶標與空白平行組溶液的吸光差值△A650/520。采集貴州大學閱湖水（北緯26°26′47″， 東經(jīng)106°39′24″）作為樣品一，稻田水（北緯26°26′55″， 東經(jīng)106°41′16″）為樣品二，果蔬地土壤（北緯26°26′49″， 東經(jīng)106°39′45″）為樣品三，在上述實際樣品中分別加入500和1000 nmol/L百草枯標準液，利用本方法測其回收率。

3 結(jié)果與討論

3.1 百草枯核酸適配體的篩選

由于本研究組前期利用19個堿基的引物與文庫雜交[8]，導致靶標洗脫的親和序列不多，所以本實驗根據(jù)文獻[26]的思路設計了12個堿基的引物P3。百草枯核酸適配體的篩選具體流程如圖1A所示，首先將ssDNA隨機文庫與生物素修飾的P3序列通過堿基互補配對，按摩爾比1∶2混勻，經(jīng)退火處理后與鏈霉素親和素修飾的納米磁珠結(jié)合，再加入百草枯靶標洗脫具有親和力的ssDNA序列。根據(jù)洗滌下來的ssDNA量/固定在磁珠上的ssDNA量，計算每輪篩選的洗脫率。由于百草枯的吸收峰與核酸分子在260 nm處的吸收峰較接近，所以在計算洗脫率時排除百草枯自身的干擾。如圖1B所示，在相同百草枯濃度下，隨篩選輪數(shù)的增加，洗脫率越來越大; 逐漸減小靶標濃度，百草枯洗脫下來的序列親和性越來越強。經(jīng)過前9輪篩選，發(fā)現(xiàn)50 μmol/L百草枯對固定親核性序列的洗脫率達到22.3%。對9輪篩選得到的非對稱PCR擴增液進行電泳與凝膠染色處理，其結(jié)果如圖1C所示。前兩輪電泳由于引物二聚體、非特異性擴增等因素導致產(chǎn)物不純，條帶出現(xiàn)混雜現(xiàn)象。其后擴增產(chǎn)物逐漸形成單一條帶，表明ssDNA序列純度逐漸提高，親和力越來越強，且每輪條帶均在50～100 bp之間，完全符合文庫設計范圍。

3.2 百草枯核酸適配體序列分析

根據(jù)本研究組前期研究結(jié)果 [8]和文獻報道，通常固定文庫法篩選適配體時， 靶標對固定序列的洗脫率在20%～30%。本實驗考慮篩選效率以及其它不確定性等因素，最終對第9輪篩選后的百草枯親和序列進行PCR擴增，并委托上海生工生物有限公司進行克隆，然后挑選克隆子進行測序，最終獲得15條與文庫堿基數(shù)一致的親和序列，并分析了它們隨機區(qū)域的堿基組成與分布，所有結(jié)果見表1。通過MEGA軟件進行發(fā)育樹分析（圖1D），進一步分析隨機序列組成與百草枯結(jié)合的關(guān)系。對15條親和序列的隨機區(qū)域進行比對后發(fā)現(xiàn)，PQ-1和PQ-3序列隨機區(qū)都出現(xiàn)了保守序列“CGGGTGG”，PQ-4和PQ-7隨機區(qū)都出現(xiàn)了保守序列“GAC”“CAA”序列片段，且所有序列的CG含量都比較高，因而推測百草枯分子與親和序列的結(jié)合能力，可能與百草枯分子和親和序列中的CG形成穩(wěn)定的次級鍵有關(guān)。

根據(jù)CG含量高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及自由能低等因素，挑選6條親和序列（PQ-7、PQ-8、PQ-12、PQ-13，、PQ-14和PQ-15），用Mfold軟件進行二級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)預測，這些序列的二級結(jié)構(gòu)主要以莖環(huán)為主，環(huán)上均出現(xiàn)了T=G錯配，這些莖環(huán)可能是親和序列與百草枯結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎，莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的莖可能起到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，環(huán)則通過氫鍵、疏水作用、堿基堆積等發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化，形成高度結(jié)構(gòu)化與百草枯結(jié)合的位點。

3.3 核酸適配體的解離常數(shù)（Kd）測定

3.4 AuNPs聚集比色檢測百草枯原理及條件優(yōu)化

利用PQ-15序列作為百草枯的識別分子，選擇陽離子聚合物PDDA調(diào)控的AuNPs聚集作為信號輸出，建立了基于核酸適配體的百草枯檢測方法，檢測原理如圖4A所示。PDDA水溶液具有高密度正電荷，基于靜電吸引使金納米粒子聚集，顏色由紅色變成藍色。由于適配體磷酸骨架基團帶有負電荷，PDDA可以與PQ-15適配體通過靜電吸附形成“Duplex”結(jié)構(gòu)，此時PDDA被消耗從而不會使后續(xù)加入的AuNPs聚集，因而整個體系展現(xiàn)出紅色，并在520 nm處有最大吸收峰（圖4B）。當體系中存在百草枯時，其先與PQ-15適配體發(fā)生親和作用形成復合物，后續(xù)再加入PDDA后會導致AuNPs聚集，此時整個體系展現(xiàn)出藍色，并在650 nm處有最大吸收峰，這種變化趨勢與百草枯濃度（500和1000 nmol/L）呈現(xiàn)正相關(guān)（圖4B），因此可用于百草枯的比色檢測。由于納米金的聚集程度與PQ-15適配體和PDDA的濃度相關(guān)，在前期預實驗基礎上，選取1～20 nmol/L的PQ-15和5～25 nmol/L的PDDA進行優(yōu)化，以A650/520表示納米金聚集程度與空白組納米金A650/520的差值△A650/520作為檢測信號。如圖4C所示，PDDA濃度為20 nmol/L達到最佳飽和狀態(tài)，少量PDDA不會使納米金完全聚集，而過多PDDA會導致更高的背景信號，降低傳感體系的靈敏度。在最佳PDDA濃度下， PQ-15核酸適配體濃度為5 nmol/L時，檢測信號達到最大值，適配體的使用量過高或過低都會影響PDDA對納米金的聚集（圖4D）。

3.5 AuNPs聚集比色法檢測百草枯性能分析

采用已優(yōu)化的條件，在體系中加入50～2000 nmol/L百草枯，空白組則用雙蒸水代替，通過酶標儀測定實驗組與空白組A650/520的吸光差值△A650/520作為檢測信號。如圖5A所示，體系的的顏色隨百草枯濃度增加逐漸變藍，濃度增加到500 nmol/L時，顏色基本達到飽和?！鰽650/520與百草枯濃度在50～500 nmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為△A650/520=0.843×104x+0.108 （R2=0.994）。根據(jù)本研究組前期報道[25]，通過3σ/slope計算得到檢出限為25.2 nmol/L（≈6.48 μg/L），低于中國農(nóng)業(yè)部制定的果蔬產(chǎn)品中百草枯最大殘留量標準（50 μg/L）。分別選取甲拌磷、啶蟲脒、敵敵畏、辛硫磷、丙溴磷、甲基對硫磷作為競爭性農(nóng)藥，采用本方法測定，結(jié)果表明，檢測體系中存在百草枯時，納米金發(fā)生聚集變藍，而加入其它農(nóng)藥的樣品組中納米金均保持紅色，PQ-15適配體對百草枯的檢測信號明顯高于其它競爭性農(nóng)藥。當競爭性靶標中加入同等濃度的百草枯后，檢測信號又恢復（圖5B），說明PQ-15適配體能特異識別百草枯農(nóng)藥，且其它農(nóng)藥對百草枯的檢測不產(chǎn)生干擾。

4 結(jié) 論

通過磁分離，經(jīng)過9輪篩選獲得百草枯的高親和性寡聚核苷酸。將所得到的親和序列進行克隆測序，得到15條完整序列。用MEGA和Mfold 軟件分析發(fā)育樹和二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)所得序列大多為莖環(huán)結(jié)構(gòu)。對親和序列進行親和力表征，百草枯核酸適配體PQ-15具有很強的親和性（Kd=（54±4） nmol/L），但百草枯與其適配體的結(jié)合機理還有待進一步探索。以親和序列作為百草枯的識別分子，以陽離子化合物聚集的納米金為傳感信號，建立了基于核酸適配體識別的百草枯農(nóng)藥比色檢測方法，檢出限為25.2 nmol/L。本方法具有快速、靈敏、低成本且易操作的優(yōu)勢，可用于實際樣品中百草枯的檢測。

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