李瓊鋒 韋袞政 徐蕾 王宮琳

摘要：目的 觀察健脾益氣通絡中藥對糖尿病腎病大鼠腎組織病理變化的影響。方法 將實驗用的60只健康雄性SD大鼠，隨機法分為6組：左腎切除組、模型組、洛汀新組、中藥低、中、高劑量組，每組收入10只，除腎切除組外，其余五組均構(gòu)建糖尿病腎病大鼠模型，并對中藥低、中、高劑量組進行對應劑量的健脾益氣通絡中藥灌胃，洛汀新組進行洛汀新灌胃，對左腎切除組、模型組進行等量生理鹽水灌胃，灌胃6周后，檢測各組大鼠24h的尿蛋白（Upro）定量、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。取腎臟開展HE染色行電鏡觀察以及透射電鏡觀察腎皮質(zhì)組織病理改變。結(jié)果 模型組大鼠與腎切組大鼠相比，光鏡及電鏡下已出現(xiàn)糖尿病腎病病理改變，各治療組腎皮質(zhì)病理改變較輕;洛汀新組、中藥低、中、高劑量組與模型組比較，24h尿蛋白（Upro）定量顯著下降（P<0.01）;各治療組與模型組比較，尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）明顯降低（P<0.05）。結(jié)論 健脾益氣通絡中藥可改善糖尿病腎病大鼠的腎功能，并可減輕腎臟的病理損害。

關鍵詞：健脾益氣通絡中藥;糖尿病腎病;大鼠;病理形態(tài)學

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2019）01-0063-03

糖尿病腎?。―N）屬于目前世界多發(fā)病和難治病，治療手段有限。現(xiàn)代研究證實：DN的基本病理改變?yōu)槟I小球萎縮或增大、系膜細胞肥大和系膜區(qū)擴張、腎小球基底膜及腎小管基底膜增厚、腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化，高濾過和腎臟肥大等。減輕腎臟病理及腎固有細胞超微結(jié)構(gòu)的損害，改善早期DN病理形態(tài)，延緩病情發(fā)展的方法和藥物，是當今醫(yī)學領域緊迫解決的重要課題。對糖尿病腎病進行健脾、益氣及通絡治療，臨床取得較好的效果。本實驗主要研究健脾益氣通絡中藥復方應用于糖尿病腎病大鼠模型中對其腎臟病理組織學及超微結(jié)構(gòu)變化的影響作用。

1 材料

1.1 實驗動物 選取60只健康雄性SD大鼠，均為SPF級，大鼠體重為200～250 g，購自昆明楚商科技有限公司。

1.2 藥物與試劑 鏈脲佐菌素（STZ），（美國 Sigma 公司）。健脾益氣通絡中藥復方由黃芪30 g，黨參20 g，茯苓20 g，白術20 g，丹參20 g，澤蘭20 g，水蛭6 g組成，用免煎中藥配方顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司），由云南中醫(yī)學院研究實驗中心制備，濃縮至含生藥1 g/mL，分裝滅菌，4℃保存?zhèn)溆?。西藥選用洛汀新（鹽酸苯那普利片，10mg/片，北京諾華制藥有限公司制造）。Trizol試劑（美國Invitrogen公司）。

1.3 主要儀器及設備 代謝籠（北京翼諾泰科技發(fā)展有限公司）;血糖儀及試紙（德國羅氏診斷公司）;電子天平（北京賽多利斯電子天平有限公司）;全自動生化分析儀（美國貝克曼公司提供）;超低溫冰箱（日本三洋公司）;電腦（北京六一儀器廠提供）;光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

2 方法

2.1 實驗動物模型 60只雄性SD大鼠，適應性喂養(yǎng)1周，分別測定尿蛋白陰性后通過背部切口行左腎切除術。2周之后隨機抽取10只為單純腎切組，剩余大鼠在其腹腔一次性注射鏈脲佐菌素（STZ）40 mg/kg，72 h之后經(jīng)尾靜脈取血檢測血糖，血糖檢測值大于或等于16.7 mmol/L，判定為DM造模成功。

2.2 實驗動物分組及給藥方法 將造模成功大鼠隨機分為5組：洛汀新組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組。洛汀新組大鼠給予西藥洛汀新0.9 mg（kg·d）灌胃，中藥低、中、高劑量組分別給予免煎中藥配方顆粒5.29 g，10.58 g，21.16 g（kg·d）灌胃，腎切組及模型組分別給予同等生理鹽水灌胃，每日1次，給藥療程共6周。大鼠自由進食、飲水，室溫保持在18℃-20℃，相對濕度，進行12 h交替照明。實驗期間每天測量1次大鼠尾靜脈血糖，對血糖大于或等于26 mmol/L的大鼠，可能危及生命，給予適量長效胰島素（1-4 u）皮下注射，避免發(fā)生糖尿病急性并發(fā)癥，減少大鼠死亡。

2.3 檢測指標

2.3.1 取材 給藥第6周末，將大鼠放入代謝籠內(nèi)，收集24h尿液，記錄總量，檢測大鼠各組的24 h尿蛋白（Upro）量（由云南中醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科檢測）。實驗結(jié)束時，所有大鼠均用10%水合氯醛腹腔注射，進行麻醉，取腹主動脈血，用于檢測血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）（由云南中醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科檢測）。

2.3.2 分離腎臟 取各組大鼠腎皮質(zhì)區(qū)組織，置于4℃預冷的4%戊二醛電鏡固定液中，制成1 mm3小塊，用玻璃吸管移至標本瓶內(nèi)，留做電鏡觀察，其余腎皮質(zhì)部分，置于10%的中性甲醛固定，留做光鏡觀察。

2.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采取統(tǒng)計學軟件（SPSS 21.0版本）進行分析統(tǒng)計。計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）的形式，多重比較使用LSD法進行，組間差異采用ANOVA單因素方差分析。P<0.05為數(shù)據(jù)檢測有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 左腎切除組大鼠精神狀態(tài)良好，飲食正常，動作敏捷，反應靈敏，肌肉豐滿，毛色光澤，尿量正常，沒用死亡情況。將鏈脲佐菌素注射后，五組大鼠均表現(xiàn)為多飲、多食及多尿，精神萎靡不振，動作遲緩，反應較為遲鈍，毛枯黃稀少，少動抱團。治療期間均有大鼠死亡情況，其中中藥中劑量組、洛汀新組各死亡2只，中藥低劑量、高劑量組各死亡3只，模型組死亡4只。

3.2 各組大鼠24h尿蛋白（Pure）定量的比較 與腎切組比較，模型組大鼠24h尿蛋白（Pure）含量顯著升高（P<0.01），各治療組Pure含量均升高（P<0.05）。與模型組比較，使用藥物干預后各組大鼠的UPro含量均顯著降低（P<0.01）。中藥低、中、高劑量組及洛汀新組之間無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。

3.3 各組大鼠腎功能的比較 與腎切組比較，模型組Scr、BUN值均明顯升高（P<0.01），各治療組Scr值無顯著差異（P>0.05），BUN值升高明顯（P<0.01）;與模型組比較，各治療組Scr值、BUN值均下降（P<0.05）。結(jié)果見表1。

3.4 腎臟病理學

3.4.1 光鏡觀察顯示 單純腎切組大鼠腎組織中的腎小球結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，未見增大及萎縮，腎小球囊腔光滑，無滲出現(xiàn)象，基底膜無增厚，系膜細胞、細胞外基質(zhì)分布正常，腎小管結(jié)構(gòu)清晰無管型;模型組大鼠腎小球萎縮，囊腔增大，系膜細胞增生，系膜區(qū)增寬。中藥組和洛汀新組病理改變均不同程度地減輕，腎小球仍有萎縮，但囊腔空隙比正常稍大，以中藥中劑量組改善最為明顯。

3.4.2 電鏡觀察顯示 單純腎切組大鼠腎臟足細胞結(jié)構(gòu)完整，足突排列整齊，分布均勻，無融合現(xiàn)象，腎小球基底膜均勻無增厚;模型組大鼠腎臟足細胞減少，足突增寬，足突融合甚至消失，腎小球基底膜彌漫性增厚。中藥組和洛汀新組病理改變均不同程度地減輕，呈現(xiàn)足突分布均勻，極少出現(xiàn)足突融合現(xiàn)象，基底膜無明顯增厚，其中中藥高劑量組作用最為明顯。

4 討論

依據(jù)糖尿病腎?。―N）不同的臨床癥狀，DN歸屬中醫(yī)“消渴”、“水腫”、“尿濁”、“虛勞”等病證范疇?，F(xiàn)代醫(yī)家治療DN“多從腎論治”。筆者認為脾為后天之本，氣血生化之源，有升清、散精、固攝和的作用。故《素問·經(jīng)脈別論》說：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通條水道，下輸膀胱，水精四布，五經(jīng)并行”。診斷為糖尿病的主要指標是血糖升高超過標準，而血糖主要來源于飲食所化之的水谷精微。若脾之健運失職，血中之糖（水谷精微），就不能輸布于臟腑而營養(yǎng)四肢百骸，水谷精微蓄積而導致血糖升高。胰島素的絕對或相對不足，相對于中醫(yī)為脾氣虛弱，運化水谷精微功能不足，脾“為胃行其津液”的物質(zhì)基礎匱乏和功能失調(diào)，故病機關鍵在于脾虛[1]。脾虛則固攝無力，精微物質(zhì)的蛋白質(zhì)流失，出現(xiàn)蛋白尿。脾為氣血生化之源，脾虛氣血生化乏源，氣虛則鼓動無力，血運遲緩，血脈瘀阻;血虛則脈絡欠充盈，血行變緩慢，血液中致病物質(zhì)沉積于脈絡，脈絡狹窄，二者均可導致瘀血而成為瘀證。若該病控制不佳，病情發(fā)展波及于腎，隨著腎受損逐漸加重，固攝無權(quán)，精微物質(zhì)持續(xù)下注，蛋白質(zhì)流失加重，尿蛋白增多。因此，在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中，總以“脾傷”、“脾虛”為始動環(huán)節(jié)，早期以脾氣虛弱，瘀血阻絡為基本病機，日久脾病傳腎。故本實驗采用健脾益氣通絡中藥復方來進行干預，并取得了較好的效果。

本實驗對單側(cè)切除腎臟合并小劑量鏈脲佐菌素（STZ），建立的糖尿病腎病大鼠模型，進行分組后，各組大鼠連續(xù)給藥6周，檢測模型組大鼠的SCr，BUN，24h尿蛋白含量均明顯高于單純腎切組（P<0.01），提示此種造模方式可導致大鼠腎損害。而與模型組比較，各治療組可不同程度降低上述各指標（P<0.05，P<0.01），表明健脾益氣通絡中藥可減輕腎臟損傷程度。

形態(tài)學檢測是最直觀、最可靠的檢驗藥物療效方法，本實驗采用最常規(guī)HE染色，光鏡觀察各組腎組織基本形態(tài)，結(jié)果顯示：模型組大鼠腎組織損傷嚴重，腎小球出現(xiàn)嚴重萎縮，囊腔增大，中藥組和洛汀新組病理改變均明顯輕于模型組。足細胞損傷在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中起到關鍵作用，足細胞是高分化細胞，沒有再生能力，足細胞數(shù)量減少所造成的腎小球濾過屏障破壞無法修復[2-3]，本實驗采用電鏡檢測足細胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示：足細胞數(shù)量減少，足突增寬、融合甚至消失，基底膜彌漫性增厚。與模型組比較，中藥組和洛汀新組病理改變均不同程度減輕上述損傷，高劑量組作用更為明顯。上述各形態(tài)學結(jié)果表明，健脾益氣通絡中藥復方能減輕糖尿病腎病腎臟病理損害及腎固有細胞超微結(jié)構(gòu)損害，對糖尿病腎病具有保護作用。

參考文獻：

[1]李瓊鋒，韋袞政，李黔云，等.健脾益氣通絡方對早期糖尿病腎病大鼠血清脂聯(lián)素與血清超敏C-反應蛋白影響的實驗研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2016，8（8）：78-80.

[2]Jim B，Santos J，Spath F，et al.Biomarkers of diabetic nephropathy，the present and the future[J].Curr Diabetes Rev，2012，8（5）：317-320.

[3]Sun D，Zhao X，Meng L.Relationship between urinary podocytes and kidney diseases[J].Ren Fail，2012，34（3）：403-407.