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        黃紫堇總生物堿在老年癡呆大鼠中的應用效果及對海馬組織Aβ、NGF的影響

        2019-05-10 04:58:50張彤蘇湲淇
        中國老年學雜志 2019年9期
        關鍵詞:紫堇奈哌生物堿

        張彤 蘇湲淇

        (1河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)內科,河北 石家莊 050000;2重慶醫(yī)藥高等??茖W校藥學院)

        阿爾茨海默病(AD)又稱為癡呆,是一種起病相對隱匿的進行性、發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認及視空間技能、執(zhí)行功能損害為主〔1〕。目前,臨床上對于AD發(fā)病機制尚不完全知曉,普遍認為與家族史、軀體疾病、頭部外傷等有關,其特征性病理改變則以海馬皮質和顳葉等部位老年斑形成、神經(jīng)纖維纏結和神經(jīng)元丟失為主,嚴重影響我國老年人健康及生活〔2〕。鹽酸多奈哌齊屬于膽堿酯酶抑制劑,能抑制乙酰膽堿水解,為機體提供足夠的乙酰膽堿,使更多的乙酰膽堿和神經(jīng)傳遞突出,改善患者癥狀〔3〕。但是,AD患者長期服用鹽酸多奈哌齊藥物依賴性較強,藥物不良反應發(fā)生率較高,導致患者預后較差〔4〕。黃紫堇總生物堿是從罌粟科植物黃紫堇中提取出來的雙重膽堿酯酶抑制劑,味苦,性微涼,具有清熱解毒、利尿止痢功效,能作用于AD后期〔5〕。研究表明〔6〕,將黃紫堇總生物堿用于老年癡呆中可改善患者記憶能力,但其作用機制尚不完全清楚。本研究探討黃紫堇總生物堿在老年癡呆大鼠中的應用效果及對海馬組織β-淀粉樣蛋白(Aβ)、神經(jīng)生長因子(NGF)的影響。

        1 資料與方法

        1.1動物與分組 選擇SPF級健康SD大鼠40只作為對象,雌雄各半,根據(jù)電腦隨機數(shù)分為空白對照組(10只)、模型對照組(10只)、鹽酸多奈哌齊組(10只)和黃紫堇總生物堿組(10只)。大鼠檢疫合格,體重160~220 g,平均(200±15)g。動物合格證號:SCXK-(吉)2007-0003,所選動物由醫(yī)學動物實驗中心提供常規(guī)飼養(yǎng),自由攝食、飲水,光照12 h,建模前12 h禁食,試驗均通過醫(yī)院動物委員會批準同意。

        1.2藥物與試劑 鹽酸多奈哌齊(國藥準字H20030583,規(guī)格:5 mg×28片/盒;陜西方舟制藥有限公司);NGF免疫組化試劑盒(南京建成生物工程研究所);跳臺試驗裝置(成都泰盟科技有限公司);黃紫堇總生物堿(批號:20120510,實驗室提供);Aβ25~35(批號:20160038,美國Sigma公司);Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司提供);水合氯醛(國藥準字:國藥準字H37022673,青島宇龍海藻有限公司)。

        1.3方法 (1)動物模型建立??瞻讓φ战M不參與模型建立,其余3組大鼠在海馬區(qū)定位注射Aβ25~35建立老年癡呆動物模型,建模前對3組大鼠進行適應性喂養(yǎng)1 w,將大鼠頭部固定在立體定位儀上,腹腔內注射10.0%水合氯醛0.4 mg/100 g,待麻醉生效后進行常規(guī)消毒、鋪巾,清潔大鼠頭頂皮膚,在正中作豎切口,以前囪后3.5 mm、硬腦膜下2.7 mm、中線外側2.0 mm部位完成海馬區(qū)定位,并且在5 min內采用微量注射器向每側注射聚集肽Aβ25~3510 μg,為了避免拔針時引起藥物外滲,研究中注射后留針5 min。術后給予牙托粉完成顱骨孔的封固,縫合切口并完成相應的消毒,建模后3 d每天肌肉注射青霉素G 10萬U。建模完畢后通過比較空白對照組與模型對照組、鹽酸多奈哌齊組和黃紫堇總生物堿組行為學判斷是否建模成功,手術后連續(xù)喂養(yǎng)21 d〔7,8〕。(2)大鼠的處理。第21天后模型對照組每天灌胃蒸餾水0.5 ml/100 g,鹽酸多奈哌齊組每天灌胃鹽酸多奈哌齊1.75 mg/kg,黃紫堇總生物堿組每天灌胃黃紫堇總生物堿4 mg/kg,連續(xù)灌胃7 d。迷宮試驗與跳臺試驗分別在給藥后7 d進行。

        1.4觀察指標及方法 (1)Morris水迷宮試驗、跳臺試驗。采用Morris水迷宮試驗、跳臺試驗觀察4組大鼠空間學習記憶能力,分別記錄潛伏時間和逃避潛伏時間〔9〕。①Morris水迷宮試驗:水迷宮共分為4個象限,平臺高于水平面1 cm,設定水溫為26℃,記錄4組大鼠2 min內找到平臺的時間(即逃避潛伏時間);對于2 min內未能找到平臺者,記錄逃避潛伏時間為2 min,每只大鼠分別在灌胃后7 d、14 d及21 d進行3次試驗,取平均值〔10〕;②跳臺試驗:平臺底部為銅棒,可通電,內側為塑料安全肽,將大鼠放置跳臺上熟悉周圍環(huán)境,準備工作完畢后進行通電刺激,電壓設定為36 V,連續(xù)跳臺300 s,記錄各組大鼠從第1次電刺激到第1次成功跳上安全平臺所需時間(即潛伏時間),每只大鼠分別在灌胃后7 d、14 d及21 d進行3次試驗,取平均值〔11〕;(2)海馬組織Aβ、NGF表達。①采用免疫組織化學法測定各組大鼠海馬組織Aβ、NGF表達。各組大鼠建模后21 d以斷頸方式處死,取海馬區(qū)組織,制備4 μm切片。向制備的切片組織中放入1份30.0%過氧化氫(H2O2)及10份蒸餾水,加入內源性酶常溫下10 min滅活,采用蒸餾水連續(xù)3次洗滌。將切片放置在0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液調節(jié)溶液pH值為6.0,利用電爐加熱,煮沸后間隔5 min,連續(xù)反復2次,常溫下冷卻后加入磷酸鹽緩沖液(PBS)進行2次洗滌,常溫下加入濃度5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液,甩去多余液體后加入1滴Aβ、NGF(稀釋濃度為1∶100)單克隆抗體,采用PBS 3次洗滌,每次2 min。采用DBA顯色試劑盒在1 ml底物中加入1滴Aβ、NGF二抗,混合均勻后制備DBA工作液,常溫下顯色,完畢后利用蘇木素復染、脫水、透明后封片,采用病理圖像分析軟件分析Aβ、NGF的光密度值,每個標本測定3次,取平均值〔12〕。(3)海馬組織HE染色。取各組大鼠海馬組織,采用甲醛進行固定,制備病理切片,進行HE染色,采用光學顯微鏡(×200)觀察大腦皮層、海馬組織病理形態(tài)〔13〕。

        1.5統(tǒng)計分析 采用SPSS18.0軟件行t檢驗、F檢驗。

        2 結 果

        2.1各組不同時間點潛伏時間及逃避潛伏時間比較 黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組、模型對照組灌胃后各時間點潛伏時間及逃避潛伏期均顯著長于空白對照組(P<0.05);黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組灌胃后各時間點潛伏時間及逃避潛伏時間顯著短于模型對照組(P<0.05);黃紫堇總生物堿組灌胃后各時間點潛伏時間及逃避潛伏時間顯著短于鹽酸多奈哌齊組(P<0.05),見表1。

        表1 各組大鼠不同時間點跳臺試驗結果比較

        與空白對照組比較:1)P<0.05;與模型對照組比較:2)P<0.05;與鹽酸多奈哌齊組比較:3)P<0.05;表2同

        2.2各組Aβ、NGF表達水平比較 黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組、模型對照組Aβ表達水平均顯著高于空白對照組(P<0.05);黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組Aβ表達水平均顯著低于模型對照組(P<0.05);黃紫堇總生物堿組Aβ表達水平低于鹽酸多奈哌齊組(P<0.05);黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組、模型對照組NGF表達水平均顯著低于空白對照組(P<0.05);黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組NGF表達水平均顯著高于模型對照組(P<0.05);黃紫堇總生物堿組NGF表達水平顯著高于鹽酸多奈哌齊組(P<0.05),見表2。

        2.3各組海馬組織HE染色結果比較 空白對照組未參與建模,海馬神經(jīng)細胞數(shù)量正常,排列規(guī)則;模型對照組大腦皮層海馬神經(jīng)細胞數(shù)量較少,層次不清,排列缺乏規(guī)律性;鹽酸多奈哌齊組大腦皮層神經(jīng)細胞發(fā)生變形,壞死現(xiàn)象減少,海馬細胞結構欠清晰;黃紫堇總生物堿組大腦皮層神經(jīng)變性較少,海馬神經(jīng)細胞數(shù)量較多,結構清晰,壞死細胞較少,見圖1。

        表2 各組Aβ、NGF表達水平比較

        圖1 各組海馬組織染色(HE,×200)

        3 討 論

        老年癡呆起病緩慢或隱匿,部分患者及家屬甚至難以說清患者何時發(fā)病,臨床多表現(xiàn)為認知功能下降、精神癥狀和行為障礙,且隨著患者病情的不斷發(fā)展,將會引起其生活質量下降〔14〕。研究表明〔15〕:老年癡呆發(fā)病影響因素較多,多與tau蛋白、載脂蛋白、Aβ有關。積極采取有效的措施干預對延緩老年癡呆發(fā)生率,改善患者預后具有重要的意義〔16〕。

        老年性癡呆主要是由于腎虛髓空、痰瘀阻腦等引起。而Aβ屬于老年斑、淀粉樣蛋白沉積的重要組成部分,在機體中能引起氧化應激反應,造成線粒體發(fā)生損傷,從而產(chǎn)生相應的神經(jīng)毒性,導致神經(jīng)細胞功能、凋亡受到影響,引起癡呆相關病理變化〔17〕。同時,Aβ還可以減少海馬、腦皮質等組織部位乙酰膽堿的釋放,引起局部組織發(fā)生瀑布炎癥聯(lián)級反應,進一步加重疾病的發(fā)生、發(fā)展。NGF屬于人體中相對重要的神經(jīng)系統(tǒng)生物活性分析,有助于促進神經(jīng)元的成熟,最大限度維持其生存、功能。研究表明〔18〕:NGF能提高腦組織膽堿能神經(jīng)纖維的數(shù)量,有助于促進受損神經(jīng)恢復,有助于改善學習、記憶功能。本研究結果表明:將黃紫堇總生物堿用于老年癡呆中有助于降低Aβ表達水平,提高NGF表達水平。黃紫堇總生物堿屬于是一種雙重的膽堿酯酶抑制劑,作用于老年癡呆中有助于恢復神經(jīng)受損,利于大鼠恢復。

        由于老年癡呆發(fā)生率伴有學習記憶能力、行為變化,并且常受到環(huán)境、聲音、氣味和溫度等多因素的干擾。本研究結果表明:黃紫堇總生物堿、鹽酸多奈哌齊均能改善大鼠認知、學習記憶能力,但是黃紫堇總生物堿效果更佳。Morris水迷宮試驗可以反映大鼠空間學習、記憶能力,試驗過程中考驗大鼠收集、利用空間定位視覺信息,并進行加固、攝取;而跳臺試驗則能反映大鼠的記憶能力,兩種試驗的聯(lián)合使用能準確反映大鼠老年癡呆嚴重程度,能為臨床診療提供思路。海馬區(qū)位于大丘腦與內側顳葉之間,屬于是一種邊緣系統(tǒng),主要負責機體長期記憶的存儲、轉換和定向等功能〔19〕。本研究結果表明將黃紫堇總生物堿用于老年癡呆大鼠中能最大限度保護海馬神經(jīng)細胞數(shù)量,減輕對于海馬區(qū)的損害。本研究更多集中在動物實驗部分,尚未能臨床實際使用、試驗;且研究中大鼠病例數(shù)較少,需要大樣本量進一步驗證〔20〕。

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