張彤 蘇湲淇

(1河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000；2重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)院)

阿爾茨海默病(AD)又稱為癡呆，是一種起病相對(duì)隱匿的進(jìn)行性、發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)及視空間技能、執(zhí)行功能損害為主〔1〕。目前，臨床上對(duì)于AD發(fā)病機(jī)制尚不完全知曉，普遍認(rèn)為與家族史、軀體疾病、頭部外傷等有關(guān)，其特征性病理改變則以海馬皮質(zhì)和顳葉等部位老年斑形成、神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失為主，嚴(yán)重影響我國(guó)老年人健康及生活〔2〕。鹽酸多奈哌齊屬于膽堿酯酶抑制劑，能抑制乙酰膽堿水解，為機(jī)體提供足夠的乙酰膽堿，使更多的乙酰膽堿和神經(jīng)傳遞突出，改善患者癥狀〔3〕。但是，AD患者長(zhǎng)期服用鹽酸多奈哌齊藥物依賴性較強(qiáng)，藥物不良反應(yīng)發(fā)生率較高，導(dǎo)致患者預(yù)后較差〔4〕。黃紫堇總生物堿是從罌粟科植物黃紫堇中提取出來的雙重膽堿酯酶抑制劑，味苦，性微涼，具有清熱解毒、利尿止痢功效，能作用于AD后期〔5〕。研究表明〔6〕，將黃紫堇總生物堿用于老年癡呆中可改善患者記憶能力，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究探討黃紫堇總生物堿在老年癡呆大鼠中的應(yīng)用效果及對(duì)海馬組織β-淀粉樣蛋白(Aβ)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的影響。

1 資料與方法

1.1動(dòng)物與分組 選擇SPF級(jí)健康SD大鼠40只作為對(duì)象，雌雄各半，根據(jù)電腦隨機(jī)數(shù)分為空白對(duì)照組(10只)、模型對(duì)照組(10只)、鹽酸多奈哌齊組(10只)和黃紫堇總生物堿組(10只)。大鼠檢疫合格，體重160～220 g，平均(200±15)g。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-(吉)2007-0003，所選動(dòng)物由醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食，試驗(yàn)均通過醫(yī)院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2藥物與試劑 鹽酸多奈哌齊(國(guó)藥準(zhǔn)字H20030583，規(guī)格：5 mg×28片/盒;陜西方舟制藥有限公司);NGF免疫組化試劑盒(南京建成生物工程研究所);跳臺(tái)試驗(yàn)裝置(成都泰盟科技有限公司);黃紫堇總生物堿(批號(hào)：20120510，實(shí)驗(yàn)室提供)；Aβ25～35(批號(hào)：20160038，美國(guó)Sigma公司)；Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司提供)；水合氯醛(國(guó)藥準(zhǔn)字：國(guó)藥準(zhǔn)字H37022673，青島宇龍海藻有限公司)。

1.3方法 (1)動(dòng)物模型建立。空白對(duì)照組不參與模型建立，其余3組大鼠在海馬區(qū)定位注射Aβ25～35建立老年癡呆動(dòng)物模型，建模前對(duì)3組大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，將大鼠頭部固定在立體定位儀上，腹腔內(nèi)注射10.0%水合氯醛0.4 mg/100 g，待麻醉生效后進(jìn)行常規(guī)消毒、鋪巾，清潔大鼠頭頂皮膚，在正中作豎切口，以前囪后3.5 mm、硬腦膜下2.7 mm、中線外側(cè)2.0 mm部位完成海馬區(qū)定位，并且在5 min內(nèi)采用微量注射器向每側(cè)注射聚集肽Aβ25～3510 μg，為了避免拔針時(shí)引起藥物外滲，研究中注射后留針5 min。術(shù)后給予牙托粉完成顱骨孔的封固，縫合切口并完成相應(yīng)的消毒，建模后3 d每天肌肉注射青霉素G 10萬U。建模完畢后通過比較空白對(duì)照組與模型對(duì)照組、鹽酸多奈哌齊組和黃紫堇總生物堿組行為學(xué)判斷是否建模成功，手術(shù)后連續(xù)喂養(yǎng)21 d〔7，8〕。(2)大鼠的處理。第21天后模型對(duì)照組每天灌胃蒸餾水0.5 ml/100 g，鹽酸多奈哌齊組每天灌胃鹽酸多奈哌齊1.75 mg/kg，黃紫堇總生物堿組每天灌胃黃紫堇總生物堿4 mg/kg，連續(xù)灌胃7 d。迷宮試驗(yàn)與跳臺(tái)試驗(yàn)分別在給藥后7 d進(jìn)行。

1.4觀察指標(biāo)及方法 (1)Morris水迷宮試驗(yàn)、跳臺(tái)試驗(yàn)。采用Morris水迷宮試驗(yàn)、跳臺(tái)試驗(yàn)觀察4組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，分別記錄潛伏時(shí)間和逃避潛伏時(shí)間〔9〕。①M(fèi)orris水迷宮試驗(yàn)：水迷宮共分為4個(gè)象限，平臺(tái)高于水平面1 cm，設(shè)定水溫為26℃，記錄4組大鼠2 min內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間(即逃避潛伏時(shí)間)；對(duì)于2 min內(nèi)未能找到平臺(tái)者，記錄逃避潛伏時(shí)間為2 min，每只大鼠分別在灌胃后7 d、14 d及21 d進(jìn)行3次試驗(yàn)，取平均值〔10〕；②跳臺(tái)試驗(yàn)：平臺(tái)底部為銅棒，可通電，內(nèi)側(cè)為塑料安全肽，將大鼠放置跳臺(tái)上熟悉周圍環(huán)境，準(zhǔn)備工作完畢后進(jìn)行通電刺激，電壓設(shè)定為36 V，連續(xù)跳臺(tái)300 s，記錄各組大鼠從第1次電刺激到第1次成功跳上安全平臺(tái)所需時(shí)間(即潛伏時(shí)間)，每只大鼠分別在灌胃后7 d、14 d及21 d進(jìn)行3次試驗(yàn)，取平均值〔11〕；(2)海馬組織Aβ、NGF表達(dá)。①采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定各組大鼠海馬組織Aβ、NGF表達(dá)。各組大鼠建模后21 d以斷頸方式處死，取海馬區(qū)組織，制備4 μm切片。向制備的切片組織中放入1份30.0%過氧化氫(H2O2)及10份蒸餾水，加入內(nèi)源性酶常溫下10 min滅活，采用蒸餾水連續(xù)3次洗滌。將切片放置在0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH值為6.0，利用電爐加熱，煮沸后間隔5 min，連續(xù)反復(fù)2次，常溫下冷卻后加入磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行2次洗滌，常溫下加入濃度5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，甩去多余液體后加入1滴Aβ、NGF(稀釋濃度為1∶100)單克隆抗體，采用PBS 3次洗滌，每次2 min。采用DBA顯色試劑盒在1 ml底物中加入1滴Aβ、NGF二抗，混合均勻后制備DBA工作液，常溫下顯色，完畢后利用蘇木素復(fù)染、脫水、透明后封片，采用病理圖像分析軟件分析Aβ、NGF的光密度值，每個(gè)標(biāo)本測(cè)定3次，取平均值〔12〕。(3)海馬組織HE染色。取各組大鼠海馬組織，采用甲醛進(jìn)行固定，制備病理切片，進(jìn)行HE染色，采用光學(xué)顯微鏡(×200)觀察大腦皮層、海馬組織病理形態(tài)〔13〕。

1.5統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組不同時(shí)間點(diǎn)潛伏時(shí)間及逃避潛伏時(shí)間比較 黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組、模型對(duì)照組灌胃后各時(shí)間點(diǎn)潛伏時(shí)間及逃避潛伏期均顯著長(zhǎng)于空白對(duì)照組(P<0.05)；黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組灌胃后各時(shí)間點(diǎn)潛伏時(shí)間及逃避潛伏時(shí)間顯著短于模型對(duì)照組(P<0.05)；黃紫堇總生物堿組灌胃后各時(shí)間點(diǎn)潛伏時(shí)間及逃避潛伏時(shí)間顯著短于鹽酸多奈哌齊組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果比較

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型對(duì)照組比較：2)P<0.05；與鹽酸多奈哌齊組比較：3)P<0.05；表2同

2.2各組Aβ、NGF表達(dá)水平比較 黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組、模型對(duì)照組Aβ表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組Aβ表達(dá)水平均顯著低于模型對(duì)照組(P<0.05)；黃紫堇總生物堿組Aβ表達(dá)水平低于鹽酸多奈哌齊組(P<0.05)；黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組、模型對(duì)照組NGF表達(dá)水平均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)；黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組NGF表達(dá)水平均顯著高于模型對(duì)照組(P<0.05)；黃紫堇總生物堿組NGF表達(dá)水平顯著高于鹽酸多奈哌齊組(P<0.05)，見表2。

2.3各組海馬組織HE染色結(jié)果比較 空白對(duì)照組未參與建模，海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量正常，排列規(guī)則；模型對(duì)照組大腦皮層海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較少，層次不清，排列缺乏規(guī)律性；鹽酸多奈哌齊組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生變形，壞死現(xiàn)象減少，海馬細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠清晰；黃紫堇總生物堿組大腦皮層神經(jīng)變性較少，海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多，結(jié)構(gòu)清晰，壞死細(xì)胞較少，見圖1。

表2 各組Aβ、NGF表達(dá)水平比較

圖1 各組海馬組織染色(HE，×200)

3 討 論

老年癡呆起病緩慢或隱匿，部分患者及家屬甚至難以說清患者何時(shí)發(fā)病，臨床多表現(xiàn)為認(rèn)知功能下降、精神癥狀和行為障礙，且隨著患者病情的不斷發(fā)展，將會(huì)引起其生活質(zhì)量下降〔14〕。研究表明〔15〕：老年癡呆發(fā)病影響因素較多，多與tau蛋白、載脂蛋白、Aβ有關(guān)。積極采取有效的措施干預(yù)對(duì)延緩老年癡呆發(fā)生率，改善患者預(yù)后具有重要的意義〔16〕。

老年性癡呆主要是由于腎虛髓空、痰瘀阻腦等引起。而Aβ屬于老年斑、淀粉樣蛋白沉積的重要組成部分，在機(jī)體中能引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成線粒體發(fā)生損傷，從而產(chǎn)生相應(yīng)的神經(jīng)毒性，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能、凋亡受到影響，引起癡呆相關(guān)病理變化〔17〕。同時(shí)，Aβ還可以減少海馬、腦皮質(zhì)等組織部位乙酰膽堿的釋放，引起局部組織發(fā)生瀑布炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)，進(jìn)一步加重疾病的發(fā)生、發(fā)展。NGF屬于人體中相對(duì)重要的神經(jīng)系統(tǒng)生物活性分析，有助于促進(jìn)神經(jīng)元的成熟，最大限度維持其生存、功能。研究表明〔18〕：NGF能提高腦組織膽堿能神經(jīng)纖維的數(shù)量，有助于促進(jìn)受損神經(jīng)恢復(fù)，有助于改善學(xué)習(xí)、記憶功能。本研究結(jié)果表明：將黃紫堇總生物堿用于老年癡呆中有助于降低Aβ表達(dá)水平，提高NGF表達(dá)水平。黃紫堇總生物堿屬于是一種雙重的膽堿酯酶抑制劑，作用于老年癡呆中有助于恢復(fù)神經(jīng)受損，利于大鼠恢復(fù)。

由于老年癡呆發(fā)生率伴有學(xué)習(xí)記憶能力、行為變化，并且常受到環(huán)境、聲音、氣味和溫度等多因素的干擾。本研究結(jié)果表明：黃紫堇總生物堿、鹽酸多奈哌齊均能改善大鼠認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶能力，但是黃紫堇總生物堿效果更佳。Morris水迷宮試驗(yàn)可以反映大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力，試驗(yàn)過程中考驗(yàn)大鼠收集、利用空間定位視覺信息，并進(jìn)行加固、攝取；而跳臺(tái)試驗(yàn)則能反映大鼠的記憶能力，兩種試驗(yàn)的聯(lián)合使用能準(zhǔn)確反映大鼠老年癡呆嚴(yán)重程度，能為臨床診療提供思路。海馬區(qū)位于大丘腦與內(nèi)側(cè)顳葉之間，屬于是一種邊緣系統(tǒng)，主要負(fù)責(zé)機(jī)體長(zhǎng)期記憶的存儲(chǔ)、轉(zhuǎn)換和定向等功能〔19〕。本研究結(jié)果表明將黃紫堇總生物堿用于老年癡呆大鼠中能最大限度保護(hù)海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量，減輕對(duì)于海馬區(qū)的損害。本研究更多集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，尚未能臨床實(shí)際使用、試驗(yàn)；且研究中大鼠病例數(shù)較少，需要大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證〔20〕。