張彤 蘇湲淇

(1河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000；2重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院)

阿爾茨海默病(AD)又稱為癡呆，是一種起病相對(duì)隱匿的進(jìn)行性、發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上以記憶障礙、失語(yǔ)、失用、失認(rèn)及視空間技能、執(zhí)行功能損害為主〔1〕。目前，臨床上對(duì)于AD發(fā)病機(jī)制尚不完全知曉，普遍認(rèn)為與家族史、軀體疾病、頭部外傷等有關(guān)，其特征性病理改變則以海馬皮質(zhì)和顳葉等部位老年斑形成、神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失為主，嚴(yán)重影響我國(guó)老年人健康及生活〔2〕。鹽酸多奈哌齊屬于膽堿酯酶抑制劑，能抑制乙酰膽堿水解，為機(jī)體提供足夠的乙酰膽堿，使更多的乙酰膽堿和神經(jīng)傳遞突出，改善患者癥狀〔3〕。但是，AD患者長(zhǎng)期服用鹽酸多奈哌齊藥物依賴性較強(qiáng)，藥物不良反應(yīng)發(fā)生率較高，導(dǎo)致患者預(yù)后較差〔4〕。黃紫堇總生物堿是從罌粟科植物黃紫堇中提取出來(lái)的雙重膽堿酯酶抑制劑，味苦，性微涼，具有清熱解毒、利尿止痢功效，能作用于AD后期〔5〕。研究表明〔6〕，將黃紫堇總生物堿用于老年癡呆中可改善患者記憶能力，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究探討黃紫堇總生物堿在老年癡呆大鼠中的應(yīng)用效果及對(duì)海馬組織β-淀粉樣蛋白(Aβ)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的影響。

1 資料與方法

1.1動(dòng)物與分組 選擇SPF級(jí)健康SD大鼠40只作為對(duì)象，雌雄各半，根據(jù)電腦隨機(jī)數(shù)分為空白對(duì)照組(10只)、模型對(duì)照組(10只)、鹽酸多奈哌齊組(10只)和黃紫堇總生物堿組(10只)。大鼠檢疫合格，體重160～220 g，平均(200±15)g。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-(吉)2007-0003，所選動(dòng)物由醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食，試驗(yàn)均通過(guò)醫(yī)院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2藥物與試劑 鹽酸多奈哌齊(國(guó)藥準(zhǔn)字H20030583，規(guī)格：5 mg×28片/盒;陜西方舟制藥有限公司);NGF免疫組化試劑盒(南京建成生物工程研究所);跳臺(tái)試驗(yàn)裝置(成都泰盟科技有限公司);黃紫堇總生物堿(批號(hào)：20120510，實(shí)驗(yàn)室提供)；Aβ25～35(批號(hào)：20160038，美國(guó)Sigma公司)；Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司提供)；水合氯醛(國(guó)藥準(zhǔn)字：國(guó)藥準(zhǔn)字H37022673，青島宇龍海藻有限公司)。

1.3方法 (1)動(dòng)物模型建立?？瞻讓?duì)照組不參與模型建立，其余3組大鼠在海馬區(qū)定位注射Aβ25～35建立老年癡呆動(dòng)物模型，建模前對(duì)3組大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，將大鼠頭部固定在立體定位儀上，腹腔內(nèi)注射10.0%水合氯醛0.4 mg/100 g，待麻醉生效后進(jìn)行常規(guī)消毒、鋪巾，清潔大鼠頭頂皮膚，在正中作豎切口，以前囪后3.5 mm、硬腦膜下2.7 mm、中線外側(cè)2.0 mm部位完成海馬區(qū)定位，并且在5 min內(nèi)采用微量注射器向每側(cè)注射聚集肽Aβ25～3510 μg，為了避免拔針時(shí)引起藥物外滲，研究中注射后留針5 min。術(shù)后給予牙托粉完成顱骨孔的封固，縫合切口并完成相應(yīng)的消毒，建模后3 d每天肌肉注射青霉素G 10萬(wàn)U。建模完畢后通過(guò)比較空白對(duì)照組與模型對(duì)照組、鹽酸多奈哌齊組和黃紫堇總生物堿組行為學(xué)判斷是否建模成功，手術(shù)后連續(xù)喂養(yǎng)21 d〔7，8〕。(2)大鼠的處理。第21天后模型對(duì)照組每天灌胃蒸餾水0.5 ml/100 g，鹽酸多奈哌齊組每天灌胃鹽酸多奈哌齊1.75 mg/kg，黃紫堇總生物堿組每天灌胃黃紫堇總生物堿4 mg/kg，連續(xù)灌胃7 d。迷宮試驗(yàn)與跳臺(tái)試驗(yàn)分別在給藥后7 d進(jìn)行。

1.4觀察指標(biāo)及方法 (1)Morris水迷宮試驗(yàn)、跳臺(tái)試驗(yàn)。采用Morris水迷宮試驗(yàn)、跳臺(tái)試驗(yàn)觀察4組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，分別記錄潛伏時(shí)間和逃避潛伏時(shí)間〔9〕。①M(fèi)orris水迷宮試驗(yàn)：水迷宮共分為4個(gè)象限，平臺(tái)高于水平面1 cm，設(shè)定水溫為26℃，記錄4組大鼠2 min內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間(即逃避潛伏時(shí)間)；對(duì)于2 min內(nèi)未能找到平臺(tái)者，記錄逃避潛伏時(shí)間為2 min，每只大鼠分別在灌胃后7 d、14 d及21 d進(jìn)行3次試驗(yàn)，取平均值〔10〕；②跳臺(tái)試驗(yàn)：平臺(tái)底部為銅棒，可通電，內(nèi)側(cè)為塑料安全肽，將大鼠放置跳臺(tái)上熟悉周圍環(huán)境，準(zhǔn)備工作完畢后進(jìn)行通電刺激，電壓設(shè)定為36 V，連續(xù)跳臺(tái)300 s，記錄各組大鼠從第1次電刺激到第1次成功跳上安全平臺(tái)所需時(shí)間(即潛伏時(shí)間)，每只大鼠分別在灌胃后7 d、14 d及21 d進(jìn)行3次試驗(yàn)，取平均值〔11〕；(2)海馬組織Aβ、NGF表達(dá)。①采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定各組大鼠海馬組織Aβ、NGF表達(dá)。各組大鼠建模后21 d以斷頸方式處死，取海馬區(qū)組織，制備4 μm切片。向制備的切片組織中放入1份30.0%過(guò)氧化氫(H2O2)及10份蒸餾水，加入內(nèi)源性酶常溫下10 min滅活，采用蒸餾水連續(xù)3次洗滌。將切片放置在0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH值為6.0，利用電爐加熱，煮沸后間隔5 min，連續(xù)反復(fù)2次，常溫下冷卻后加入磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行2次洗滌，常溫下加入濃度5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，甩去多余液體后加入1滴Aβ、NGF(稀釋濃度為1∶100)單克隆抗體，采用PBS 3次洗滌，每次2 min。采用DBA顯色試劑盒在1 ml底物中加入1滴Aβ、NGF二抗，混合均勻后制備DBA工作液，常溫下顯色，完畢后利用蘇木素復(fù)染、脫水、透明后封片，采用病理圖像分析軟件分析Aβ、NGF的光密度值，每個(gè)標(biāo)本測(cè)定3次，取平均值〔12〕。(3)海馬組織HE染色。取各組大鼠海馬組織，采用甲醛進(jìn)行固定，制備病理切片，進(jìn)行HE染色，采用光學(xué)顯微鏡(×200)觀察大腦皮層、海馬組織病理形態(tài)〔13〕。

1.5統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組不同時(shí)間點(diǎn)潛伏時(shí)間及逃避潛伏時(shí)間比較 黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組、模型對(duì)照組灌胃后各時(shí)間點(diǎn)潛伏時(shí)間及逃避潛伏期均顯著長(zhǎng)于空白對(duì)照組(P<0.05)；黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組灌胃后各時(shí)間點(diǎn)潛伏時(shí)間及逃避潛伏時(shí)間顯著短于模型對(duì)照組(P<0.05)；黃紫堇總生物堿組灌胃后各時(shí)間點(diǎn)潛伏時(shí)間及逃避潛伏時(shí)間顯著短于鹽酸多奈哌齊組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果比較

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型對(duì)照組比較：2)P<0.05；與鹽酸多奈哌齊組比較：3)P<0.05；表2同

2.2各組Aβ、NGF表達(dá)水平比較 黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組、模型對(duì)照組Aβ表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組Aβ表達(dá)水平均顯著低于模型對(duì)照組(P<0.05)；黃紫堇總生物堿組Aβ表達(dá)水平低于鹽酸多奈哌齊組(P<0.05)；黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組、模型對(duì)照組NGF表達(dá)水平均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)；黃紫堇總生物堿組、鹽酸多奈哌齊組NGF表達(dá)水平均顯著高于模型對(duì)照組(P<0.05)；黃紫堇總生物堿組NGF表達(dá)水平顯著高于鹽酸多奈哌齊組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3各組海馬組織HE染色結(jié)果比較 空白對(duì)照組未參與建模，海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量正常，排列規(guī)則；模型對(duì)照組大腦皮層海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較少，層次不清，排列缺乏規(guī)律性；鹽酸多奈哌齊組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生變形，壞死現(xiàn)象減少，海馬細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠清晰；黃紫堇總生物堿組大腦皮層神經(jīng)變性較少，海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多，結(jié)構(gòu)清晰，壞死細(xì)胞較少，見(jiàn)圖1。

表2 各組Aβ、NGF表達(dá)水平比較

圖1 各組海馬組織染色(HE，×200)

3 討 論

老年癡呆起病緩慢或隱匿，部分患者及家屬甚至難以說(shuō)清患者何時(shí)發(fā)病，臨床多表現(xiàn)為認(rèn)知功能下降、精神癥狀和行為障礙，且隨著患者病情的不斷發(fā)展，將會(huì)引起其生活質(zhì)量下降〔14〕。研究表明〔15〕：老年癡呆發(fā)病影響因素較多，多與tau蛋白、載脂蛋白、Aβ有關(guān)。積極采取有效的措施干預(yù)對(duì)延緩老年癡呆發(fā)生率，改善患者預(yù)后具有重要的意義〔16〕。

老年性癡呆主要是由于腎虛髓空、痰瘀阻腦等引起。而Aβ屬于老年斑、淀粉樣蛋白沉積的重要組成部分，在機(jī)體中能引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成線粒體發(fā)生損傷，從而產(chǎn)生相應(yīng)的神經(jīng)毒性，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能、凋亡受到影響，引起癡呆相關(guān)病理變化〔17〕。同時(shí)，Aβ還可以減少海馬、腦皮質(zhì)等組織部位乙酰膽堿的釋放，引起局部組織發(fā)生瀑布炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)，進(jìn)一步加重疾病的發(fā)生、發(fā)展。NGF屬于人體中相對(duì)重要的神經(jīng)系統(tǒng)生物活性分析，有助于促進(jìn)神經(jīng)元的成熟，最大限度維持其生存、功能。研究表明〔18〕：NGF能提高腦組織膽堿能神經(jīng)纖維的數(shù)量，有助于促進(jìn)受損神經(jīng)恢復(fù)，有助于改善學(xué)習(xí)、記憶功能。本研究結(jié)果表明：將黃紫堇總生物堿用于老年癡呆中有助于降低Aβ表達(dá)水平，提高NGF表達(dá)水平。黃紫堇總生物堿屬于是一種雙重的膽堿酯酶抑制劑，作用于老年癡呆中有助于恢復(fù)神經(jīng)受損，利于大鼠恢復(fù)。

由于老年癡呆發(fā)生率伴有學(xué)習(xí)記憶能力、行為變化，并且常受到環(huán)境、聲音、氣味和溫度等多因素的干擾。本研究結(jié)果表明：黃紫堇總生物堿、鹽酸多奈哌齊均能改善大鼠認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶能力，但是黃紫堇總生物堿效果更佳。Morris水迷宮試驗(yàn)可以反映大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力，試驗(yàn)過(guò)程中考驗(yàn)大鼠收集、利用空間定位視覺(jué)信息，并進(jìn)行加固、攝取；而跳臺(tái)試驗(yàn)則能反映大鼠的記憶能力，兩種試驗(yàn)的聯(lián)合使用能準(zhǔn)確反映大鼠老年癡呆嚴(yán)重程度，能為臨床診療提供思路。海馬區(qū)位于大丘腦與內(nèi)側(cè)顳葉之間，屬于是一種邊緣系統(tǒng)，主要負(fù)責(zé)機(jī)體長(zhǎng)期記憶的存儲(chǔ)、轉(zhuǎn)換和定向等功能〔19〕。本研究結(jié)果表明將黃紫堇總生物堿用于老年癡呆大鼠中能最大限度保護(hù)海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量，減輕對(duì)于海馬區(qū)的損害。本研究更多集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，尚未能臨床實(shí)際使用、試驗(yàn)；且研究中大鼠病例數(shù)較少，需要大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證〔20〕。