潘理會(huì) 李育莊 李春輝

(承德醫(yī)學(xué)院 1血流變學(xué)與分子細(xì)胞學(xué)研究室，河北 承德 0670000；2附屬醫(yī)院病理科)

研究報(bào)道結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)生、發(fā)展與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路EGFR/大鼠肉瘤(RAS)/鼠類(lèi)肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B1(BRAF)的調(diào)控密切相關(guān)〔1〕，近年一些靶向EGFR的單抗藥物已成功應(yīng)用于CRC的臨床治療，取得良好療效，但抗EGFR單抗藥物的有效性受其下游RAS基因〔包括大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、大鼠肉瘤病毒轉(zhuǎn)化基因(NRAS)〕類(lèi)型的影響，對(duì)RAS野生型攜帶者療效顯著，對(duì)RAS突變型患者療效不佳。目前檢測(cè)KRAS和NRAS基因突變狀態(tài)已成為眾多專(zhuān)家學(xué)者研究腫瘤靶基因治療的熱點(diǎn)課題，本文采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)KRAS、NRAS基因在CRC組織中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理參數(shù)探討二者在CRC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2012年12月至2015年5月間承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的CRC蠟塊標(biāo)本238例。所選標(biāo)本均有完整的臨床病歷及病理資料，且術(shù)前均未接受任何化療及抗腫瘤藥物治療。

1.2DNA提取 將CRC石蠟包埋組織連續(xù)切片4 μm厚1～2張，蘇木精-伊紅(HE)染色，顯鏡下觀察形態(tài)，標(biāo)記腫瘤細(xì)胞比例達(dá)70%以上的標(biāo)本。將做好標(biāo)記的標(biāo)本連續(xù)切片8～10 μm厚5～6張，常規(guī)脫蠟、水化處理，刮取腫瘤組織于EP管內(nèi)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取DNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取DNA的質(zhì)量和濃度，A260/A280在1.7～2.1之間為符合標(biāo)準(zhǔn)。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 采用PCRTaqMan探針技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本中KRAS、NRAS基因的突變情況，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。反應(yīng)體系包括模板50 ng、正反向引物各25 pmol、Master Mix及TaqMan標(biāo)記探針，總反應(yīng)體系各為50 μl。反應(yīng)條件分3步：第1步：42℃ 5 min，95℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；第2步：95℃ 25 s，64℃ 20 s，72℃ 20 s，15個(gè)循環(huán)；第3步：93℃ 25 s，60℃ 35 s，72℃ 20 s，31個(gè)循環(huán)，第3階段60℃收集信號(hào)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)定突變的陰、陽(yáng)性及空白對(duì)照孔。

1.4結(jié)果判讀 以無(wú)模板對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)設(shè)定閾值，沒(méi)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線或Ct≥28.0的標(biāo)本為陰性標(biāo)本；出現(xiàn)擴(kuò)增曲線且Ct≤26.0的標(biāo)本為陽(yáng)性標(biāo)本；26.0

1.5試劑與儀器 石蠟組織DNA提取試劑盒及人KRAS、NRAS基因突變檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自杭州赫貝科技有限公司。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1KRAS基因突變情況及與臨床病理特征的關(guān)系 86例(36.1%)KRAS基因突變，隨著淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Duke分期的增高KRAS突變率明顯增加(P<0.05)，在其他臨床病理特征的組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2NRAS基因突變情況及與臨床病理特征的關(guān)系 11例(4.6%)NRAS基因突變。NRAS突變率在各臨床病理特征的組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3CRC組織中KRAS與NRA基因突變的相關(guān)性 未檢測(cè)到KRAS與NRAS同時(shí)突變者，表明二者突變相互排斥，相關(guān)分析顯示，KRAS與NRAS 突變沒(méi)有明顯相關(guān)性 (r=0.782，P=0.058)。

表1 CRC組織中KRAS基因突變與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

表2 CRC組織中NRAS基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

EGFR是一種酪氨酸激酶受體，與配體結(jié)合后激活刺激其介導(dǎo)的下游信號(hào)傳導(dǎo)通路膜受體酪氨酸蛋白激酶信號(hào)傳遞途徑(RAS/RAF/MAPK)發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖、轉(zhuǎn)移，發(fā)生癌變〔1〕?？笶GFR單抗可通過(guò)拮抗其與配體的結(jié)合，阻止其活化，進(jìn)而阻斷其下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而發(fā)揮抗瘤作用。KRAS與NRAS基因是EGFR通路下游調(diào)控因子RAS家族的重要成員，二者中任何一種發(fā)生突變都可不通過(guò)EGFR活化刺激而直接激活EGFR通路引發(fā)癌變。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道在CRC中KRAS突變率為30%～55%，主要發(fā)生在2外顯子12和13密碼子上；NRAS突變率為1%～6%，主要發(fā)生在3外顯子61密碼子上〔2,3〕。國(guó)內(nèi)研究報(bào)道CRC中KRAS突變率為43.8%,NRAS突變率較低為1.9%〔4〕。也有報(bào)道CRC中KRAS突變率為42.57%，NRAS突變率為3.96%〔5〕。本研究與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的基本相符，同時(shí)本研究數(shù)據(jù)顯示KRAS突變率明顯高于NRAS，KRAS突變?cè)贑RC中是常見(jiàn)的生物學(xué)事件，可能是CRC發(fā)病的主要機(jī)制之一，而NRAS可能不是主要機(jī)制。KRAS的突變狀態(tài)可作為臨床選用抗 EGFR單抗藥物的重要參考指標(biāo)，而NRAS突變狀態(tài)的預(yù)測(cè)價(jià)值還在探討中。研究表明，對(duì)CRC患者行單一檢測(cè)KRAS基因是不夠的，還要聯(lián)合檢測(cè)NRAS基因，只有聯(lián)合檢測(cè)KRAS、NRAS基因的CRC的患者才能建議使用EGFR靶向藥物治療〔6〕，所以，腫瘤組織中NRAS突變率雖然偏低，其突變狀態(tài)的檢測(cè)是不可忽視的，聯(lián)合檢測(cè)KRAS、NRAS基因突變狀況，對(duì)篩選出適應(yīng)抗EGFR靶向藥物治療的患者有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

目前，關(guān)于KRAS和NRAS突變狀態(tài)與CRC中臨床病理參數(shù)的關(guān)系報(bào)道無(wú)統(tǒng)一定論。有文獻(xiàn)報(bào)道，CRC中KRAS突變?cè)谟辛馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期增加的患者中明顯增高〔7〕；CRC中KRAS突變更常見(jiàn)于女性和近端結(jié)腸〔8〕；CRC中NRAS突變?cè)谶h(yuǎn)端結(jié)直腸癌突變率較高〔9〕；還有研究報(bào)道CRC患者KRAS/NRAS突變與年齡相關(guān)，≥65歲的老年患者突變率較高，而與性別、原發(fā)部位、組織學(xué)類(lèi)型、分化程度、分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)〔10,11〕。吳新新等〔12〕對(duì)147例CRC患者的KRAS和NRAS基因突變情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)KRAS突變的發(fā)生更傾向于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Duke分期C期患者，與年齡、性別、腫瘤部位、組織學(xué)類(lèi)型、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、癌結(jié)節(jié)及美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)分期等均無(wú)關(guān)；NRAS突變與上述所有病理特征均無(wú)相關(guān)關(guān)系。代云等〔13〕對(duì)265例CRC患者的KRAS和NRAS基因突變情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)二者突變與年齡相關(guān)，高齡患者突變率較高，而與性別、原發(fā)部位、組織學(xué)類(lèi)型、分化程度、TNM分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征均無(wú)關(guān)。本研究表明KRAS參與了CRC的侵襲、轉(zhuǎn)移，預(yù)示患者預(yù)后不良；KRAS突變對(duì)高危轉(zhuǎn)移患者的早期篩選和預(yù)后評(píng)估有重要參考價(jià)值，也為腫瘤的侵襲、復(fù)發(fā)機(jī)制研究提供了新的方向。上述結(jié)論各家研究，差異很大，造成這些差異的原因，可能與各家研究的樣本量、檢測(cè)方法及判讀標(biāo)準(zhǔn)不同等因素有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究探討。上述研究結(jié)果表明KRAS和NRAS雖同為一個(gè)家族成員，同為EGFR信號(hào)通路下游重要的效應(yīng)因子，但在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所起的調(diào)控作用不盡相同。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)CRC中EGFR信號(hào)通路上KRAS/NRAS突變狀態(tài)與臨床病理參數(shù)關(guān)系的研究剛剛興起，許多認(rèn)識(shí)還不夠成熟，尤其對(duì)NRAS的檢測(cè)較少且檢出率偏低，提示臨床CRC患者抗EGFR藥物治療時(shí)，應(yīng)多基因聯(lián)合檢測(cè)來(lái)指導(dǎo)靶向藥物方案的制定。明確KRAS/NRAS與CRC病理參數(shù)的相關(guān)性，有助于闡明CRC發(fā)病機(jī)制，有助于CRC的靶基因治療。對(duì)二者突變狀態(tài)的檢測(cè)還應(yīng)擴(kuò)大檢測(cè)規(guī)模，采取多種研究手段，綜合論證分析。目前，關(guān)于腫瘤中KRAS和NRAS突變之間相關(guān)性的研究國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道，有資料顯示，CRC中KRAS和NRAS之間基本不存在交叉突變〔14〕，二者突變相互排斥〔15〕。本研究與上述研究結(jié)果相一致，經(jīng)相關(guān)分析顯示，KRAS和NRAS之間突變沒(méi)有關(guān)聯(lián)，提示二者可能是彼此獨(dú)立的影響著CRC的進(jìn)程，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。