唐楚林，肖 林，章 群，周 琪，徐 示，王業(yè)磷

（暨南大學(xué)生態(tài)系，廣州 510632）

笛鯛屬（Lutjanus）魚類（下文簡稱笛鯛）隸屬鱸形目 （Perciformes）笛鯛科 （Lutjanidae），據(jù)Fishbase（http：／／www.fishbase.org／）記載該屬魚類全世界約有67種，中國南海有20多種［1］。笛鯛主要分布在世界熱帶及亞熱帶海域珊瑚礁或紅樹林生境，是產(chǎn)地名貴經(jīng)濟(jì)魚類，并具有重要生態(tài)服務(wù)功能。但近年來，一方面受珊瑚礁和紅樹林被人為破壞和環(huán)境污染影響，其棲息地縮小退化［2］；另一方面因其肉質(zhì)鮮美、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高且具有產(chǎn)卵集群現(xiàn)象而遭受過度捕撈，笛鯛資源現(xiàn)狀不容樂觀［3］。

準(zhǔn)確的物種鑒定是開展海洋生態(tài)調(diào)查和魚類資源養(yǎng)護(hù)措施制訂的前提。由于傳統(tǒng)的笛鯛分類主要基于外部形態(tài)計(jì)測特征和體表斑點(diǎn)條紋特征，不僅高度依賴分類專家個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)也易受不同發(fā)育階段影響，如形態(tài)上笛鯛仔魚表現(xiàn)出與鮨科（Serranidae）和石鱸科（Haemulidae）等在珊瑚礁生息的其它科魚類類似的形態(tài)特征；不同物種間外部形態(tài)特征部分重疊，條紋斑點(diǎn)較為類似且不同發(fā)育階段有變化，采集后會褪色［4］，因而需要突破表型分類的局限，建立更有效的笛鯛分類鑒定方法。

DNA條形碼［5］通過對一段標(biāo)準(zhǔn)目的基因DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序分析進(jìn)行物種鑒定，不受外部形態(tài)特征和個(gè)體發(fā)育階段的影響。2003年HERBERT等［6］對13 320個(gè)物種的 COⅠ基因分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)物種種內(nèi)遺傳距離小于1%，很少大于2%，遺傳距離種間接近或大于種內(nèi)10倍；2005年 WARD等［7］對澳洲207種魚類的研究表明，絕大部分魚類都能被COⅠ基因部分序列有效區(qū)分。對鳥類、昆蟲等［8-9］越來越多的研究表明，基于COⅠ基因的DNA條形碼在動物分類、物種鑒定、隱存種的發(fā)掘等方面都具有極其廣泛的應(yīng)用。

目前國內(nèi)外對于笛鯛的研究主要集中在生理生態(tài)［10］和分子系統(tǒng)學(xué)研究方面［11-13］，DNA條形碼僅有VICTOR等［14］鑒定不同發(fā)育階段的巴西笛鯛（L.cyanopterus），王中鐸等［1］測序分析國內(nèi)3省5個(gè)地點(diǎn)13種笛鯛13個(gè)標(biāo)本等少數(shù)報(bào)道。上述研究雖解決了部分笛鯛的分類問題，但僅局限于少數(shù)種類與地點(diǎn)。本研究測定了中國沿海19個(gè)地點(diǎn)11種笛鯛73個(gè)COⅠ基因部分序列，并結(jié)合從GenBank下載中國及鄰近海域69條同源序列，旨在明確部分種類的分類地位，豐富和補(bǔ)充中國笛鯛屬魚類的COⅠ基因DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，為種質(zhì)資源的養(yǎng)護(hù)調(diào)查提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及分子實(shí)驗(yàn)

本研究測定的勒氏笛鯛（L.russelli）、金焰笛鯛（L.fulviflamma）、奧氏笛鯛（L.ophuysenii）、約氏笛鯛（L.johni）、藍(lán)點(diǎn)笛鯛（L.rivulatus）、五線笛鯛 （L.quinquelineatus）、紫 紅 笛 鯛 （L.argentimaculatus）、千年笛鯛（L.sebae）、紅鰭笛鯛（L.erythopterus）、馬拉巴笛鯛（L.malabaricus）和黃笛鯛（L.lutjanus）等中國11種笛鯛73尾為2004年4月—2014年8月取自中國沿海19個(gè)地點(diǎn)，并置于95%乙醇中固定保存，依據(jù)Fishbase并參照《中國魚類系統(tǒng)檢索》和《南海魚類志》進(jìn)行形態(tài)鑒定。樣品采集情況和下載的序列信息見表1。

表1 測定或下載的笛鯛屬魚類信息Tab.1 Details of sequenced and downloaded sequences of Lutjanus

·續(xù)表1·

取100 mg魚背肌肉晾干后，參考樂小亮等［15］改進(jìn)的酚／氯仿法提取總DNA。使用本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的引物：COⅠF：5′-TGTAAAAC GACGGCCAGTCCTGTGGCAATYACDCGCTGAT，COⅠR：5′-CAGGAAACAGCTATGACNACYTCNG GRTGNCCRAAGAA，采用30μL的 PCR反應(yīng)體系［16］：上下游引物 （10μmol·L-1）各0.3μL，10×PCR緩沖液 （含1.5 mmol·L-1MgCl2）3μL，BSA和 dNTPs（2 mmol·L-1）各1.2μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U·μL-1）0.5μL，DNA模板 1μL，加ddH2O補(bǔ)充至終體積30μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。將條帶清晰明亮的擴(kuò)增產(chǎn)物送往北京六合華大基因公司切膠純化，并于ABI-3730自動測序儀上進(jìn)行測序。

1.2 數(shù)據(jù)處理

利用Clustal W軟件對測定的序列進(jìn)行人工校對后，與下載的序列合并，經(jīng)MEGA7.0軟件計(jì)算堿基組成、變異位點(diǎn)、簡約位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)換／顛換的比值，基于Kimura 2-parameter模型（即 K2P）計(jì)算種間和種內(nèi)遺傳距離，構(gòu)建鄰接樹（neighborjoining tree），并以自舉檢測（bootstraps）1000次獲得支持率［17］，同時(shí)采用自動條形碼間隙檢索方法（automatic barcode gap discovery，ABGD）進(jìn)行假設(shè)種分析［18］。

2 結(jié)果與分析

截取652 bp的標(biāo)準(zhǔn)條形碼序列區(qū)［5-7］，發(fā)現(xiàn)在142條序列中沒有堿基插入和缺失；共有223個(gè)變異位點(diǎn)，其中210個(gè)簡約信息位點(diǎn)。堿基T、C、A、G的平均含量分別為 28.1%、28.5%、24.6%和18.8%，A＋T含量（52.7%）高于 G＋C含量（47.3%），表現(xiàn)出了堿基組成偏倚性，該結(jié)果與COⅠ基因堿基組成中普遍存在的AT含量高于GC含量的特征一致［7］。轉(zhuǎn)換與顛換比（R）為3.94，表明堿基突變尚未達(dá)到飽和，適合系統(tǒng)發(fā)育分析［19］。

基于K2P模型的18種笛鯛的種間和種內(nèi)遺傳距離見表2。結(jié)果表明，平均遺傳距離種間與種內(nèi)分別為14.92%和0.55%，種間平均遺傳距離是種內(nèi)的27倍，符合HEBERT［6］提出的10倍種間／種內(nèi)遺傳分歧比的參考標(biāo)準(zhǔn)。種內(nèi)遺傳距離除畫眉笛鯛（L.vitta）（2.5%）外，其余均小于2%的種內(nèi)閾值。種間遺傳距離除藍(lán)點(diǎn)笛鯛和星點(diǎn)笛鯛（L.stellatus）間為2.1%、紅鰭笛鯛和馬拉巴笛鯛間僅有0.3%外，其余物種在4.1% ～21.7%。

在鄰接樹上，18種笛鯛形成了18個(gè)分支（圖1），平均遺傳距離分支間 14.4% （2.9% ～21.8%）約為分支內(nèi) 0.17%（0～0.6%）的 85倍（圖2），與ABGD分析結(jié)果一致（圖3）：當(dāng)種內(nèi)先驗(yàn)遺傳距離為0.77%～2.15%時(shí)，笛鯛屬被分成了18個(gè)假設(shè)種。18種笛鯛中10種笛鯛獨(dú)立成支，根據(jù)遺傳距離種內(nèi)≤2%，種間≥種內(nèi)10倍標(biāo)準(zhǔn)［6］，支持其物種有效性。另外，勒氏笛鯛進(jìn)一步分成2個(gè)支持率為100%的小支：一支與印度笛鯛（L.indicus）THA1和 THA8混雜在 Clade 1，另一支在Clade 2獨(dú)立成支；紅鰭笛鯛和馬拉巴笛鯛聚合在Clade 18上；GenBank下載的畫眉笛鯛TW1、星點(diǎn)笛鯛TW1和TW2分別與本實(shí)驗(yàn)形態(tài)鑒定并測序的奧氏笛鯛和藍(lán)點(diǎn)笛鯛混雜在同一分支上（Clade 6和Clade16）。

圖1 基于線粒體COⅠ基因序列的18種笛鯛鄰接樹Fig.1 Neighbor-joining tree based on mtDNA COⅠsequences of 18 Lutjanus species

圖2 18種笛鯛分支間（左）與分支內(nèi)（右）遺傳距離Fig.2 Histogram of genetic distance between（left）and within（right）clades

圖3 笛鯛屬魚類的ABGD分析圖Fig.3 Automatic barcode gap discovery analyses of Lutjanus注：橫坐標(biāo)表示先驗(yàn)種內(nèi)分化值，縱坐標(biāo)表示劃分類群的數(shù)量Note：Abscissa means prior intraspecific divergence，ordinate means the number of groups produced

3 討論

3.1 紅鰭笛鯛和馬拉巴笛鯛分類地位的探討

雖然紅鰭笛鯛和馬拉巴笛鯛體色均為紅色，體側(cè)無任何縱帶，側(cè)線上方鱗片均斜向后背緣排列，可數(shù)性狀重疊等形態(tài)特征較為相似，但又并不完全相同，如前者側(cè)線下方鱗片均與體軸呈斜行排列，后者側(cè)線下方鱗片則與體軸平行排列，并且魚尾柄上有黑色鞍狀斑且鑲以珍珠似的白色邊緣［11］。在鄰接樹上二者聚為一支，分支內(nèi)遺傳距離（0.3%）和種間遺傳距離（0.3%）均在一般物種的種內(nèi)遺傳范圍（≤2%）內(nèi)。譚圍等［13］也得到類似結(jié)果。

這種形態(tài)有一定差異但分子上卻非常接近的情況，在其它物種中也曾有過報(bào)道，如柳淑芬等［20］發(fā)現(xiàn)棘頭梅童魚（Collichthys lucidus）和黑鰓梅童魚（C.niveatus）雖形態(tài)有差異，但種間遺傳距離僅為0.4%，推斷尚未達(dá)到物種分化的程度。宮亞運(yùn)等［21］發(fā)現(xiàn)黑斑緋鯉（Upeneus tragula）和馬六甲鯡鯉（U.moluccensis）間遺傳距離僅有0.3%，但可從體側(cè)縱帶和背鰭顏色進(jìn)行區(qū)分，認(rèn)為可能是近期輻射進(jìn)化導(dǎo)致的。由此可見，紅鰭笛鯛和馬拉巴笛鯛可能仍屬同一物種，或近期分化的不同物種。另外，由于同屬物種種間雜交情況并不鮮見，雜交后代形態(tài)上可能傾向于其中一親本或雙親的中間形態(tài)，而線粒體呈母系遺傳方式，導(dǎo)致分子與形態(tài)鑒定不一致的情況出現(xiàn)，故不能排除種間雜交的可能。

3.2 其它笛鯛分類地位的探討

1）勒氏笛鯛分為2個(gè)100%支持率的小支Clade 1和Clade 2，小支間平均遺傳距離（2.9%）是小支內(nèi)（0.5%）的 5.8倍，種內(nèi)遺傳距離1.3%，推測2個(gè)小支可能仍屬于同一個(gè)物種，但其準(zhǔn)確的物種分類地位尚待研究。

2）下載序列星點(diǎn)笛鯛 Lutset TW1和 Lutset TW2與本研究測定序列藍(lán)點(diǎn)笛鯛混雜在Clade 16上，前者種內(nèi)遺傳距離為1.8%，并未達(dá)到種的分化水平；且二者的種間遺傳距離為2.1%，表明二者可能隸屬同一物種，或是沒有完成譜系揀選的近期形成的物種，當(dāng)然也不排除種間雜交或前者錯誤鑒定的可能。

3）因無法對下載序列進(jìn)行形態(tài)鑒定，對部分類群的分類地位在此僅作如下推測：

①下載的印度笛鯛序列Lutind THA1和Lutind THA8與本實(shí)驗(yàn)測序的勒氏笛鯛聚在Clade 1上，分支內(nèi)遺傳距離為0，屬種內(nèi)差異；其余印度笛鯛獨(dú)立成支。由于印度笛鯛和勒氏笛鯛的外部形態(tài)特征較為相似，可能因發(fā)育階段的不同而出現(xiàn)特征重合，推測二者出現(xiàn)混雜可能是魚類鑒定有誤。

②下載的畫眉笛鯛序列Lutvit TW1與奧氏笛鯛聚合在Clade 6上，其余的畫眉笛鯛占據(jù)了Clade 7，分支間遺傳距離（6.6%）是分支內(nèi)遺傳距離 0.3%（0.1% ～0.5%）的 22倍，滿足HERBERT等［9-10］提出的“10 ×法則”，但畫眉笛鯛2個(gè)分支間的遺傳距離為2.5%，超過種內(nèi)遺傳距離一般小于2%的閾值。從外部形態(tài)上看，奧氏笛鯛體側(cè)縱帶上有一暗色橢圓大斑，而畫眉笛鯛并不具該特征，表明下載的畫眉笛鯛序列Lutvit TW1可能隸屬奧氏笛鯛。

綜上所述，基于COⅠ基因的DNA條形碼技術(shù)能夠?qū)Φ氧爩俳^大部分魚類進(jìn)行有效的區(qū)分，說明線粒體COⅠ基因作為笛鯛屬DNA分類條形碼是可行的，但仍存在一定的局限性，如紅鰭笛鯛和馬拉巴笛鯛，可能受到錯誤鑒定、種間雜交或者近期分化等多種因素的影響而出現(xiàn)了聚類在同一分支上的情況，僅進(jìn)行線粒體COⅠ基因分析不能很好地區(qū)分。另外，本研究未能獲取中國笛鯛全部報(bào)道的物種。因此，在今后的工作中仍需補(bǔ)充其它物種，同時(shí)結(jié)合形態(tài)測量、核基因標(biāo)記以及生物學(xué)研究，以進(jìn)一步明確中國笛鯛的分類地位。